Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

Содержание

	Введение	2
1	Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений	3
2	Генная инженерия	5
3	Практическое применение генной инженерии растений с использованием Ti – плазмид	9
	Заключение	12
	Список использованной литературы	13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

         Бурное развитие новых методов исследований в генетике, расширение и углубление наших представлений о структуре и законах организации наследственного аппарата клетки обусловили создание и разработку принципиально новых методов. Раньше генетическое разнообразие форм растений и животных – исходного материала для селекции – экспериментально создавалось в селекции методами гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и др. Теперь ученые могут достигать еще большего разнообразия благодаря манипулированию отдельными клетками живого организма, и отдельными генами. Родились новые понятия и направления современной генетики как: клеточная и генная инженерия. При этом принципиальное отличие данных методов от традиционно используемых в селекции, например мутагенеза, состоит в целенаправленном, а не случайном расширении границ изменчивости генотипа, в планируемом разнообразии исходного материала для селекции.

         Клеточная  инженерия – это использование комплекса генетических, клеточных или молекулярно-генетических методов при создании организмов с нужными человеку свойствами. В том случае, когда манипуляции осуществляют на уровне отдельных генов или их фрагментов, говорят о генной инженерии.

         В зависимости от целей исследования работу ведут на следующих уровнях приложения биотехнологических и генетико-инженерных методов: 1) молекулярном, когда дело касается отдельных частей генов, 2) генном, 3) хромосомном, 4) плазмидном, 5) клеточном, 6) тканевом, 7) организменном, 8) популяционном.

 

 

 

Цель: Целью данной работы является изучение генной и клеточной инженерии и ее значение в селекции растений, а также соматическую гибридизацию отдаленных видов растений.

 

Задачи: Задачей данной работы является понять и установить на основе примеров каким образом  применяют генную и клеточную инженерию для получение новых устойчивых видов сельскохозяйственных растений.

 

 

 

 

 

 

1. Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

        Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг. Развитие ряда новых методических приемов привело к расширению возможностей генетической инженерии на клеточном уровне. Определяющую роль сыграл метод гибридизации соматических клеток путем слияния изолированных протопластов (содержимого растительной клетки, освобожденной ферментативным путем от жесткой оболочки). Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Такие протопласты от различных растений, в том числе и относящихся к разным видам, легко сливаются, объединяя в гибридной клетке генетическую информацию родительских форм. Например, можно получить слившиеся клетки ячменя и моркови, сои и кукурузы и т. д. Но такое слияние имеет смысл, только если оно приводит в результате к развитию полноценного организма. Затем из этой гибридной клетки можно вырастить целое растение. Данный метод позволяет создавать новые формы растений, не существующие в природе.

         Получение протопластов клеток растений оказалось возможным путем обработки в гипертонической среде клеток мезофилла ферментами пектиназой и целлюлазой, действующими на соединительные ткани листа и клеточные оболочки. В этой среде протопласты представляют собой сферические образования зеленого цвета, отделенные от окружающей среды только цитоплазматической мембраной. Для обеспечения слияния протопластов растительных клеток в качестве индуктора используют нитрат натрия, полиэтиленгликоль и другие вещества. После слияния двух протопластов в единый протопласт появляется возможность клонирования целого растения с суммой признаков родительских форм. При слиянии клеток разных видов удается получать соматические, или парасексуальные, гибриды. Этот способ открывает большие перспективы для генетической инженерии растительных клеток, особенно для создания таких геномов, которые вследствие строгой половой несовместимости родительских растений нельзя получить генеративным путем.

        Методика соматической гибридизации предусматривает последовательное осуществление следующих этапов:

 

1) препарирование в стерильных условиях нужной ткани;

 

2) приготовление суспензии клеток из ткани, например из мезофилла листа выбранных родительских растений;

 

3) ферментативное растворение оболочек клеток и получение оголенных протопластов;

4) стимуляции клеток;

5) обеспечение слияния ядер;

6) отбор слившихся гетерокарионтов;

7) обеспечение начала деления клеток;

8) регенерация гибридных растении.

        Даже упрощенное изображение этого процесса ясно показывает сложность создания соматических гибридов. Тем не менее гибридные растения путем слияния соматических клеток уже на 1.01.1985 г. были получены в 104 случаях, из них 35 внутривидовых, 48 межвидовых, 9 межродовых, 12 межтрибных и 16 межсемейственных гибридов. С практической точки зрения наибольший интерес представляет соматическая гибридизация различных видов одного рода.

        При гибридизации  соматических клеток растений  их предварительно освобождают  от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных  протопластов. В этом случае, как  и при гибридизации клеток  животных, также удаётся преодолевать  барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой) гибридизации растений разных видов и родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллус, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.

         Слияние протопластов открывает и другие возможности, более реальные на ближайшее время. Если основная доля генетической информации в клетке высших растений содержится в ядре, то часть ее, как известно, заключена в органеллах цитоплазмы: хлоропластах (обеспечивающих фотосинтез) и митохондриях (обусловливающих клеточное дыхание). Например, генетическая информация об устойчивости к гербицидам хранится в хлоропластах, а о мужской стерильности— в митохондриях. Мужская стерильность растений позволяет организовать массовое производство гибридных семян без кастрации материнских форм. В последние годы выявилась генетическая новизна соматических гибридов относительно сочетания ядерной и внехромосомной наследственности, они принципиально отличаются от половых: первые наследуют внеядерные гены от обоих родительских растений, вторые — только по материнской линии. Полагают, что при соматической гибридизации можно получить 12 жизнеспособных ядерно-цитоплазматических комбинаций, в то время как при половом процессе — только две.

         Получение различных ядерно-цитоплазматических комбинаций открывает совершенно новые возможности для селекций. В качестве примера практического использования этого метода можно привести работы с рапсом в Национальном институте агрономических исследований Франции. Была поставлена задача получить растения рапса с мужской стерильностью. В первой серии опытов путем классической межвидовой гибридизации рапса и редиса получили мужскистерильные растения рапса, в клетках которых ядро происходило от рапса, а цитоплазма от редиса. Мужская стерильность таких растений обусловлена митохондриями редиса, что очень удачно с агрономической точки зрения. Однако из-за присутствия в клетках хлоропластов редиса данные растения желтеют и не имеют нектарников, которые очень важны для привлечения пчел - опылителей. Для устранения этих недостатков осуществили слияние протопластов стерильного рапса с протопластами нормального рапса, в результате чего сформировались растения с ядром и хлоропластами нормального рапса и лишь с митохондриями редиса в клетках. Такие растения сохранили мужскую стерильность, но уже не желтеют, а цветки их имеют нектарники. Полагают, что последнее связано с рекомбинацией митохондриальной ДНК.

        Таким образом, с помощью соматической гибридизации можно получить многие отдаленные гибриды высших растений, чего нельзя добиться традиционными методами. С другой стороны, становится все более очевидным, что наибольшая результативность практической селекции зависит от разумного сочетания классических методов, возможности которых далеко не исчерпаны, с новыми методами генетической инженерии.

         Параллельно с разработкой методов гибридизации соматических клеток определилось и другое направление — клонирование протопластов для использования в практической селекции. У некоторых видов (табак, томат, морковь и др.) возможно формирование целого растения из отдельного протопласта после регенерации клеточной оболочки и образования каллуса. За последние 7—8 лет в этом направлении получены обнадеживающие практические результаты. Протопласты могут быть хорошими реципиентами для введения чужеродной генетической информации и как исходный материал для соматической гибридизации.

 

2. Генная инженерия

 

        Генная инженерия зародилась в недрах молекулярной генетики. Это новая генетическая технология, позволяющая экспериментировать с отдельными генами и их частями. Однако словосочетание «генная инженерия» все же несколько необычно: термин «инженерия» далек от биологии и предопределяет инженерные методы, а «генная» — передачу генетически обусловленных признаков. И действительно, генная инженерия на основе тщательного анализа материального носителя наследственной информации позволяет реконструировать наследственность. Использование методов генной инженерии дало возможность наладить промышленное производство ряда важных биологически активных веществ для лечения и диагностики наследственных заболеваний. В их числе прежде всего следует назвать инсулин: в ряде стран уже налажен его промышленный выпуск. Суть метода заключается в том, что гены одних организмов вводят в геномы других видов, порой очень отдаленных, чего нельзя добиться традиционным методом гибридизации. С помощью генной инженерии считается принципиально возможным включать в геном избранной клетки гены от практически любых организмов и даже гены, синтезированные химическими методами. Пока успехи в этой области достигнуты лишь на уровне микроорганизмов — на бактериях и фагах.

         А какова же все-таки роль генной инженерии в селекции растений? Ряд исследователей на основании накопленного в данной области опыта приходили к выводу, что в прикладных областях генная инженерия не даст чего-либо сверхзначительного. В то же время ее перспективность в решении некоторых конкретных вопросов бесспорна. Тем более, что с начала 80-х гг. введение в клетки растения чужеродных генов стало свершившимся фактом.

        Для улучшения сортов нужный ген вводят в растительную клетку с помощью специальных векторов (рекомбинантных плазмид Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes). Затем из трансформированной клетки методом культуры тканей регенерируют полноценное растение с новыми биологическими свойствами, дающее семена нового сорта. Здесь представлены генно-инженерные манипуляции с растениями при участии этих бактерий. Agrobacterium tumefaciens вызывает у растений рак. Бактерия содержит плазмиду Ti, сегмент которой (Т-ДНК) способен встраиваться в хромосомную ДНК растительной клетки. Инфекция индуцирует синтез соединений — опинов, которые служат бактерии пищей. Этот механизм инфекции используют для введения в растения чужеродных генов. Идея, проиллюстрированная на рисунке, сводится к включению нужного гена в сайт Т-ДНК и к трансформации клетки растения такой рекомбинантной плазмидой. Клетка должна регенерировать в полноценное растение, причем встроенный ген лишает  Т-ДНК ее опухолевых свойств.

        Используя данный метод, удалось выделить ген устойчивости к гербицидам, который был перенесен в клетки табака, чтобы попытаться регенерировать из них устойчивые растения. Группа исследователей из США трансформировала клетки подсолнечника геном фазеолина (резервного белка фасоли), который хорошо экспрессировался в регенерировавших растениях и передавался потомству. Другая группа ученых успешно пересадила ген одного из ферментов фотосинтеза (точнее, малой его субъединицы),  который экспрессируется у полученного потомства.

         Использование в качестве вектора рекомбинантной плазмиды бактерии Agrobacterium rhizogenes имеет некоторую специфику. Она обладает плазмидой Ri, в которой также содержится т-ДНК, способная встраиваться в хромосомную ДНК растительных клеток. В данном случае Т-ДНК вызывает обильное корнеобразование — синдром hairy-root. Эта Т-ДНК функциональна, поскольку трансформированные клетки корней синтезируют опины. Преимущества данного вектора (в сравнении  с плазмидой Ti) состоят в том, что регенерация из корней представляется намного более простой и быстрой, чем из клеток раковой  опухоли.

        Проблем, связанных с применением генно-инженерных методов в селекции растений, много. Рассмотрим проблему обеспечения их питательными элементами. Растения окружены азотом атмосферы, но не могут им воспользоваться без посредников. К сожалению, в природе таких посредников мало — это азотфиксирующие бактерии. Уже давно пропагандируется смелая идея передать зерновым культурам группы генов nif из бактерий, фиксирующих атмосферный азот, и тем самым избавиться от необходимости вносить под указанные культуры азотные удобрения. Но, к сожалению, эта идея может навсегда остаться мечтой. Переносить придется 17 генов. И если предположить, что это удастся и все гены будут «работать», например, в геноме пшеницы, то, по оценкам специалистов, урожайность такого растения снизится на 20—30% (в пересчете на сухое вещество) вследствие энергозатрат на фиксацию азота.