Гендердің өсімдікке тасымалдануы және олардың экспрессиясы

ЖОСПАРЫ:

 

КІРІСПЕ

НЕГІЗГІ  БӨЛІМ:

а) Гендік ниженерия

ә) Гендердің өсімдікке тасымалдануы және олардың экспрессиясы

 

ҚОРЫТЫНДЫ

ПАЙДАЛАНЫЛҒАН  ӘДЕБИЕТТЕР

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кіріспе

 

Соңғы жылдары молекулалық биология мен генетика ғылымдарының жетістіктеріне байланысты гендік инжерения ғылымы пайда болды. Гендік инженерия организмдердің жаксы қасиеттерін сақтап қалумен қатар оған сапалы қасиет бере алады. "Инженерия" термині құрастыру деген мағынаны білдіреді.

Гендік (генетикалық) инженерияны – молекулалық және клеткалық инженерия белгілі  бір мақсатпен жасанды айқын  қасиеттері бар генетикалық материалдарды  алдын ала құрастырып, оларды басқа  клеткаға енгізіп, көбейтіп, зат алмасу процесін өзгеше жүргізу. Бұл әдіспен  организмдердегі тұқым қуалайтын  информацияны көздеген мақсатқа сай  өзгертіп, олардың геномдарын белгілеген жоспармен қайта құруға болады.  
Гендік инженерия ол функциональдық активті генетикалық құрылымдарды рекомбинаттық (ата-ана екі ДНК молекулалары арасынан пайда болған будан) ДНҚ молекулалары түрінде қолдан құрастыру. Гендік инженерияның мәні жеке гендерді бір организмнен алып, басқа организмге көшіріп орналастыру.

Бұл рестриктаза  деген фермент пен лигаза ферментінің  ашылуы негізінде мүмкін болды. Рестриктаза ферменті ДНҚ молекуласын нақты белгіленген жерлерін кесіп алады да, осылай фрагменттерді (рестрикция сайттарын) түзеді. Ал лигаза ферменті гетерогендік ДНҚ-ның фрагменттерін бүтін тігеді. Құрамында шығу тегі әр түрлі ДНҚ-лары бар молекуланы рекомбинаттық молекула деп атайды.

Рекомбинаттық ДНҚ-прокариоттардың немесе вирустардың ДНҚ-ы (вектор)+эукариоттардың ДНҚ-ы (бөтен ДНҚ). Вектордың көмегімен эукариоттардың бөтен ДНҚ-ы клеткаға еніп, геномға интеграциялана алады. Сонымен, прокариоттар мен вирустардың зерттелетін ДНҚ молекулалары нақты белгіленген жерден кесіліп, одан кейін бұл жерге эукариоттардың қажетті бөтен гені енгізіледі, осылайша рекомбинаттық (гибридтік) ДНҚ түзіледі.

Түзілген рекомбинаттық  ДНҚ тірі жасушаға енгізіледі, жаңа геннің экспрессиясы (көріну күші) басталғаннан соң, жасуша сол ген белгілеген белокты синтездей бастайды. Сонымен, жасушаға рекомбинаттық ДНҚ молекуласы түрінде жаңа генетикалық информацияны енгізіп, соңында жаңа белгісі бар организмді алуға болады. Мұндай организмді трансгендік немесе трансформацияланған организм дейді. Осылайша, гендік инженерияның дамуына негіз болған молекулалық биология мен молекулалық генетиканың мынадай жетістіктері бар:

1. Рестриктазалар мен лигаза ферменттерінің ашылуы;

2. Гендерді химиялық заттарды және ферменттерді қолдану арқылы синтездеу;

3. Бөтен генді клеткаға тасымалдаушы-векторларды пайдалану;

4. Бөтен генге ие болған клеткаларды таңдап, бөліп алу жолдарының ашылуы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Гендік инженерияның мақсаты — алдын ала белгіленген үлгіге сәйкес генотипі жағынан жақсарған организмдер алу. Молекулалық биология ғылымы жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиетте бере алады.

Алғашқы рет   рекомбинанттық    ДНҚ 1972 жылы АҚШ-та Стэнфорд университетінде  П.Бергтың лабораториясында жасалды. Онда пробирка ішінде түрлі микроорганизмнің ДНҚ-лары лямбда фагтың және ішек бактериясының ДНҚ фрагменттері мен маймылдың онкогендік вирусының толық геномы қосылған еді.

Өсімдіктердің гендік инженериясы саласында бірінші  жүмыстар in vitro өсірілетін жасушалармен 1980 жылы жүргізілген. 1983 жылы алдымен күнбағыстың трансгендік каллусы, кейін сол каллустан табиғатта мүлдем болмаған санбин өсімдігі алынады. Санбин (ағ.sunflower - күнбағыс, bean-бұршақ) деген ол геномында бұршақтың белогы фазеолинді кодтайтын гендері бар күнбағыс өсімдігі еді. Гендік инженерия гендерді тасымалдау тәсілі ретінде болашақта екпе өсімдіктердің селекциясының тиімді аспабы бола алады. Қазіргі кезде гендік инженерия алғашқы қадамдарын басып,екпінді дамып келеді.

Гендік инженерияның әдістемелік негізі жапырақтың мезофилл жасушаларының немесе каллус ұлпасының протопластары болады. Жаңа генетикалық ақпаратқа ие болған протопласты өсіріп, одан регенерат өсімдігін алуға болады. Генетикалық трансформация үшін сомалық жасушалардан басқа тозаң жасушалары, жұмыртқа жасушасы қолданылады. Сонымен, in vitro өсірілетін жасушаларға гендік инженериның әдістерін қолданып, өсімдіктердің бағалы белгілері бар негізінде жаңа формаларын құруға болады. Гендік инженерияның жұмысы мынадай кезеңдерден тұрады:

1. Басқа организмге көшірілетін құрылымдық генді алу;
2. Оны вектордың құрамына енгізу, яғни рекомбинанттық ДНҚ жасау;
3. Рекомбинанттық ДНҚ – ын өсімдік жасушасына тасымалдау;
4. Өсімдік клеткаларында бөтен ДНҚ – ның экспрессиясын талдау;
5. Геномы өзгерген жеке жасушалардан регенерант өсімдігін алу.

Құрылымдық гендерде тек қана метаболизм өтудің нәтижесінде түзілетін заттардың коды жазылған. Оларда ген активтілігін реттейтін бөлшек мүлдем жоқ. Сондықтан жаңа құрылымдық гендерді иеленген жасушаларда ол гендер өз  бетімен тиісті  қызметін  атқара алмайды.

Гендердің жасушаларындағы әрекетін басқаратын репликация және транскрипция сигналдарын оларға қамтамсыз етеді.

Бөтен генді жасуша ішінде тасымалдап алып баратын арнаулы ДНҚ молекуласын вектор дейді. оган мынадай талаптар қойылады:

1. өз алдына репликациялану, яғни жасуша ішінде бөтен генді алып кірген соң жасушамен бірге немесе өз алдына көбейе алатын болуы керек, немесе вектор жасуша хромосомасының кұрамына еніп, сонымен бірге ұрпақ жасушаларға беріліп отыруы керек;
2. трансформацияланған жасушаларды анықтау үшін оның ерекше гентикалық белгілері болуы керек;
3. құрамында рестриктазалар үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек және репликацияға қабілетін жоғалтпау керек;
4. векторға орналастырылған бөтен ген оның атқаратын қызметін бұзбауы керек, ал вектор болса, ол да енгізілген геннің ішінде дұрыс реттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек;
5. вектордың көлемі кішігірім болуы керек.

Әдетте, кұрылымдық ген өте қысқа болып келеді. Оны бірден көп мөлшерде бөліп  алу қиын. Сондықтан оның көшірмелерін жетерліктей көбейту керек. Генді клондау үшін бактериялар қолданылады. Мысалы, өте жақсы тексерілген, зияны жоқ, кең таралған бактерия ішек таяқшасы. Керекті ген орналастырылған векторды бактерияға енгізеді. Бактерия тез бөлінетіндіктен, оның ішіндегі вектор да, ген де бактериямен бірге көбейеді. Ақырында өскен бактерия биомассасынан вектор мен ген, яғни рекомбинанттық ДНҚ көп мөлшерде бөлініп алынады.

Генетикалық материалды жасушаларға енгізу әдістері  әжептеуір көп, атап айтқанда:

1. Жасушаларды агробактериялармен бірге өсіру;

2. Пропластарға ДНҚ-ны ПЭГ және Са көмегімен енгізу.

3. ДНҚ-ны липосомаларға салып тасымалдау.
4. Электропорация.
5. Электрофорез.
6. Микроинъекция.
7. Баллистикалық әдісі.
8. Жапырақ бөлшегі әдісі.

Қосжарнақты өсімдіктерге агробактериялардың ауру жұктыруы табиғаттта кең   таралған құбылыс. Тәжірибеде   өсімдік жасушаларынан трансформациясын in vitro өткізген қолайлы. Т-ДНҚ жүйесін қолданып бүтін өсімдіктер мен протопластарда көптеген эксперименттер жасалған. Трансформацияланған кейбір өсімдіктер ұрпақтары алынған. Оларға бөтен ген енгізу аркасында пайда болған жаңа қасиеттер Мендель заңы бойынша тұрақты тұқым қуалайды. Вируленттік агробактерияларды протопластармен арласа бірге өсіргенде трансформация өту үшін жасуша қабығының қайта құрылуы қажет. Бұл құбылыс жасуша қабығының түзілуін тежейтін заттарды қолдану және де бактериялардың протопластарға қосылуын тежейтін ЭДТА қолдаану арқылы дәлелденген. Қара алқа протопластарын А.rhizogenes бактериясымен бірге өсіргенде жақсы нәтиже алынған. Трансформацияланған каллустардың 70%-ынан регенерант өсімдіктер шыққан.

Бұл әдістің модификациясы, ол протопластарды бактериялардың сферопластарымен бірге өсіру. Қызғылт қабыршөптің протопластары агробактериялардың октопиндік Ті-плазмидасы бар сферопластарымен ПЭГ және поливинил спирті көмегімен қосылған. Одан кейін протопластар гормондары жоқ қоректік ортаға көшірілген. Өсіп шықкан жасуша колонияларында октопиннің түзілетіндігі анықталған, яғни жасуша хромосомаларының құрамында Т-ДНҚ болғандығы дәлелденген. Осы бағытта протопластарға ПЭГ жэне Са көмегімен Т-ДНҚ-ны тікелей енгізу тәжірбиелері жасалған. Трансформацияланған жасушалар гормондары жоқ ортада өсіріліп сұрыпталған.

Жалаңаш ДНҚ протопластарға тасымалданғанда, оны қорғау үшін ДНҚ-ны липосомаларға салады, әйтпесе жасушадағы нуклеаза ферменттері оны ыдыратып жібереді. Протопластар фюзоген көмегімен липосомалармен оңай қосылады немесе эндоцитоз арқылы олардың ішінде сіңеді. Бұл әдіспен ДНҚ-ны жасушаларға қай өсімдік түрі болса да енгізуге болады. Канамицинге төзімділік гені бар плазмида теріс заряды бар липосомаларға салынып, ПЭГ көмегімен темекінің мезофильдік протопластарымен қосылған. Канамицинге төзімді: жасушалардан трансформацияланган регенерант өсімдіктер алынған. Бұл әдістің артықшылығы, арнайы ДНҚ молекуласын құрастырудын кажеті жоқ, ал кемістігі - трансформациялау жиі өтпейді.

Бұл әдістің тиімділігін арттыру жолы бар, ол электропорация, яғни жасуша мембранасын электрлік токпен тесу. Көптеген зерттеушілер жоғары кернеу бар өте қысқа мерзімде өтетін разрядты қолданады. Электропорация  әдісімен  гендер  қосжарнақты  өсімдіктердің  және  де даражарнақты өсімдіктердің протопластарына тасымалданған. Тасымалдау нәтижесін бір-екі тәуліктен кейін байқауға болады. Электрошоктан тірі калған жасушалар антибиотикке төзімді келеді.

Осы әдістермен протопластарға ДНҚ енгізілгенде, өсімдік геномына оның бірнеше көшірмелері тіркесуі мүмкін. Шамасы, олар хромосоманың бір сайтына орналасады. Протопластардан регенераттарды алу кейде қиын болады, сондықтан электропорация әдісін қолданып бүтін жасушаға бөтен генді енгізу тиімді көрінеді. Мысалы, темекінің мезофилл жасушаларына электропорацияны қолданып темекі теңбіл кеселі вирусының РНҚ-сы енгізілген. Әсіресе бұл әдісті пісіп жетілген тозаң жасушаларына қолдану тиімді. Бүтін өсімдіктерге бөтен ДНҚ енгізу тәжірбиелері нәтиже берген жоқ. Сондықтан өсімдіктердің трансформациясын табысты өткізу жолында ізденістер жалғастырылуда.

Жануар жасушаларының трансформациясы микроинъекция арқылы нәтижелі өтеді. Өсімдік жасушаларында ДНҚ ерітіндісін құю техникалық жағынан едәуір қиын. Ол үшін сыртқы диаметрі 2 мкм инелер мен арнаулы микроманипулятор қолданылады. Әрбір протопластқа инъекция жасалатын ДНК ерітіндісін көлемі 10-10мл болады. Темекінің жапырақ мезофиллінің және каллустың протопласатарына канамицинге төзімділік гені бар плазмидалар инъекция арқылы енгізілген. Содан кейін протопластар 0,5-1,0 мм микроколониялар болып көбейгенше әдеттегі ортада өсіріледі, кейін канамицинь бар селективтік ортаға көшірілген. Алынған төзімді жасушалар линияларының геномында енгізілген бөтен ДНҚ фрагменттері болғандығы блот-гибридизация әдісімен анықталады. Бұл тәжірбие көрсеткендей, микроинъекция әдісі өсімдік клеткаларын трансформациялау үшін нәтижелі, әсіресе тура ядроға жасаған микроинъекция.

Сонғы жылдары баллистикалық әдіс кеңінен пайдаланып келеді. Алтын 
вольфрам микробөліктерінің бетіне кальцийді, полиэтиленгликольді пайдаланып ДНҚ-ны қондырады, одан кейін сол микробөліктермен арнайы қондырғы арқылы өсімдік жасушаларын анықтайды. Металл бөліктері 300-600 м/с жылдамдығымен жасуша қабығын жэне мембраналарды тесіп өтеді. Жасушаға енген ДНҚ белгісіз жолмен ДНҚ-на кіреді. Бұл әдіспен әр түрлі өсімдіктерді, соның ішінде даражарнақтылар мен қылқан жапырақтыларды трансформациялауға болады. Реципиент ретінде әр түрлі ұлпалар қолданылады.

Трансформацияның  әдісінің тағы бір түрі - хромосомалық инженерия. 
Ол бір мезетте көптеген тіркескен гендерді бірге тасымалдауға жол 
ашады. Бұл   бағыттың маңызы, өсімдіктердің   құнды қасиеттері мультигендік, яғни көп гендермен кодталатын болады. Жоғарыда аталған әдістердің кемшілігі, ол протопластарды бөліп алу қиыншылықтары. Регенерация процесі ұзаққа созылатындықтан, өсіп шыққан өсімдіктерде мутациялар, хромосомалар кұрылысында өзгерістер болуы әбден мүмкін.

Сонымен, генетикалық ақпаратты өсімдікке енгізу әдістері аз емес, және де оларды жетілдіру жұмыстары жалғасып жатыр. Осы бағыттағы соңғы бір жетістік - «жапырақ бөлшегі» әдісі. Ол бүтін өсімдіктің деңгейінде гендер экспрессиясын анықтауды жеңілдетеді және тездетеді. Бұл әдісте агробактериялардың гендерді тасымалдау қабілеті эксплант ретінде қолданатын жапырақ бөлшектерінің регенерацияға кабілетімен сайма-сай келеді. Бұл әдіс темекіде, қызанақта, қарбызда сынап көрілген.

Темекінің жапырақ дисктеріне ісік туғызатын қабілеті жоқ. Ті-плазмидасының құрамында канамицинге төзімділік гені бар. А tumefaciens штаммын жұқтырған. Жапырақ дискілері Петри табақшаларында екі күн бойы бактериялармен бірге өсірілген. Кейде олар 50 мг/л канамицині бар селективтік ортаға көшірілген. Дисктерде жапырақ регенерациясы 2-4 апта өткен соң басталады. 4-7 аптадан кейін тамырлар пайда болады. Канамцин бар ортада өскен трансформанттардың геномында Т-ДНҚ бар блог-гибридизация әдісі арқылы дәлелденді. Бұл әдістің артықшылыгы, гендердің тасымалдануы, өсімдіктер регенерациясы және трансформанттар селекциясы бір жүйеде жалғаса өтуі. Бұл әдіс агробактерияпар жұқтыратын және жапырақтан регенерациясы жүретін өсімдіктердін барлық түрлеріне жарамды.

С.Өмірұлы  мен М.Қарабаев   жүгеріні   гентикалық трансформациялау жүргізудің  тиімді  жүйесін  жете  зерттеп дайындады. Ол эмбриогендік протопластарға  тікелей   ДНҚ   енгізу   арқылы   ұрықтана алатын регенеранттарды алуға негізделген. Вектор ретінде pMGPI  жэне pN29 плазмидалары пайдаланылған. Оларға қолдан жасалған промотор тігілді. Ол промотор бидайдың а-амилаза генінің қысқартылған промоторынан және   ТҚТВ   358-промоторының     қос        энхансерлік элементінен құрасты-рылған еді. Жүгері   клеткаларында тасымалданатын негізгі   ген ол В-D-глюкуронидаза     ферментінің     құрылымдық     гені     болған. Бүл ферменттерді  ыдыратады. Векторлардың құрамында селективтік маркер ретінде неомицинфосфотрансфераза мен фосфотрицин-ацетил-трансфераза гендері болған. Бірінші фермент неомицин тектес антибиотиктердің активтігін тежеген, екіншісі-фосфотрицин гербицидтің активтігін тежеген. Сондықтан, бұл гендер бар клеткалар антибиотик пен гербицид косылған ортада тірі қалған яғни трансформацияланған клеткаларды сұрыптауға мүмкін болған. Эмбриогендік клеткалар суспензиясынан алынған протопластарға ПЭГ көмегімен рекомбинаннттық ДНҚ енгізілген. Трансформаттарды кейін канмицин мен фосфотрицинге төзімділігі аркылы сұрыпталған. Жасушаларды х-glис бояумен өңдегенде, трансфор-мацияланғандары GUS-гені көмегімен сол затты ыдырату нәтижесінде көк түсті болып шыққан. Боялған жасушалар мен колонияларын регенерант өсімдіктер алынған. 11 млн протопластардан 140 трансгендік өсімдіктер алынған. Олар нормалы өсімдіктер болған, басым көпшілігінде морфологиялық өзгерістер немесе дамуында ауытқулары болмаған. Айқас тозаңданудан кейін олардан кұнды ұрықтар алынған. Тасымалданған гендер тұқым қуалаған, келесі буындарда бар және GUS -гені жоқ өсімдіктер болған. Жүгері өсімдіктерінің әр түрлі ұлпаларында GUS-геннің экспрессиясы гистохимиялық әдісімен зерттеледі. Сонда жас жапырақтар, жапырақтағы түтік шоқтардың қоршау жасушалары, эпидермис және мезофилл жасушалары, сабақ түтік шоқтары, тамыр оймақшасы және тамыр түтік шоқтары көк түске боялды. Осы тәсілдерді қолданып жасушалық деңгейде бидайдың тұракты генетикалық трансформантары алынды. Бұл жұмыс астық тұқымдастар жасушалары мен өсімдіктерін генетикалық өзгерту және қайта құрастыру үшін биоинженерия әдістерін қолдануға болатындығын көрсетті.