Фитопаразитические нематоды в ризосфере основных декоративных культур

Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Российский Государственный Аграрный Университет имени К. А. Тимирязева

 

 

 

ОТЧЕТ

по практике на тему:

Фитопаразитические нематоды в ризосфере основных декоративных культур.

 

 

 

Подготовила:

                                                                              студентка 4 курса 402 группы

                                                                              агрономического факультета

Храмова Надежда

                                                                             Научный руководитель:

Петруня И.В

Москва 2013

 

Содержание.

 

 

 

1.Введение

2.Цели и задачи

3.Материалы и методики

         3.1 Методы выделения нематод

         3.2 Методы  учета

         3.3 Фиксация

         3.4 Приготовление  препаратов

         3.5 Определение  нематод

         3.6 Сроки  и место отбора образцов

4. Результаты

5. Выводы

6. Список литературы

 

 

 

 

 

 

1.Введение.

Круглые черви, или нематоды (лат. Nematoda, Nematodes) — тип первичнополостных червей. В настоящее время описано более 24 тыс. видов паразитических и свободноживущих нематод, однако оценки реального разнообразия, основывающиеся на темпах описания новых видов (в особенности, специализированных паразитов насекомых), предполагают существование около миллиона видов. Нематоды являются второй по видовому разнообразию группой царства животных после насекомых.

О вреде, наносимом нематодами сельскому хозяйству, свидетельствуют многочисленные сведения из различных стран мира. Так, только в США ущерб от них (в зависимости от культуры) составляет ежегодно 5-20%. Часто паразитические нематоды являются первопричиной болезни растений. Нанося механические повреждения покровным эпителиальным тканям и снижая толерантность растений к патогенам, нематоды тем самым способствуют проникновению и интенсивному развитию грибной, бактериальной и вирусной инфекций. Нематодные болезни растений (травянистых, древесных, кустарников) вызывает ряд вредоносных растениеядных нематод. Встречаются у многих диких и культурных растений. Наиболее часто внешние признаки нематодных поражений растений проявляются замедлением появления всходов, роста и развития саженцев, слабым цветением, частичной (иногда значительной) гибелью растений в молодом возрасте, снижением или гибелью урожая. В процессе питания нематоды нарушают целостность корней, тем самым способствуя проникновению в растение патогенных грибов, бактерий и вирусов. Внедрение нематод в корни растений обычно вызывает сильное ветвление корневой системы и отгнивание мелких корней (свекловичная, картофельная, овсяная гетеродеры), образование галлов разной формы (галловые нематоды на корнях овощных и технических культур), заострённых вздутий — «клювиков» (угрица лат. Anguina radicicola на корнях диких злаков), язв, приводящих к отмиранию корней. Стеблевые нематоды вызывают веретеновидное утолщение стеблей, недоразвитие листовой пластинки и её деформацию, у земляники: вздутие листовых черешков, усов и гофрировку листовой пластинки; образование на периферии клубней картофеля мягких тёмных пятен; растрескивание донца и разрыхление ткани сочных чешуй у луковичных растений.

В ходе своей работы я определяла  фауну фитопаразитических нематод основных декоративых культур в Центральном регионе. Актуальность моей работы заключается в том, что данная область является малоизученной, и в России представлена только работами Матвеевой М.А(1989) и Нестерового П.И(1985). А значение декоративных растений в нашей жизни трудно переоценить – экономическое, биологическое, эстетическое. И так как нематоды являются одной из самых многочисленных групп вредителей на Земле нам необходимо знать противника в лицо – изучить их видовой состав и особенности.

2.Цели  и задачи

Определение фауны фитопаразитических нематод основных декоративных культур в Центральном регионе.

 

3.Материалы и методики.

Все почвы в той или иной степени заселены нематодами. При обследовании прикорневой почвы глубина выемок должна определяться залеганием основной массы корней исследуемого вида растений. Например, при обследовании однолетних сеянцев сосны или лиственницы почвенные пробы отбирают с глубины 10-15 см в ризосфере корней. С увеличением возраста растений увеличивается соответственно и глубина выборки. В первом случае прикорневую почву можно брать совком, лопатой, во втором – почвенным буром (при глубине залегания корней от 40 см и более).

Отбор проб производится через одинаковые интервалы по 1-2 диагоналям участка и на отдельных полосах. В пределах полос возможно также продвигаться зигзагообразно и отбирать случайные пробы. Увеличение количества проб анализируемой почвы на исследуемой площади повышает точность обнаружения нематод, но при этом возрастают затраты труда. Помимо прикорневой почвы, на наличие нематод исследуется и корневая система растений (вся или частично) в зависимости от размера растения. Если объем корневой системы большой, то для анализа можно использовать стандартный образец весом 1 г.

Хорошим материалом для хранения проб являются полиэтиленовые мешочки. Выделение нематод из корней или из почвы можно проводить сразу или спустя несколько дней. В последнем случае мешочки помещают в холодильник и хранят при температуре +4° С.

При хранении почвы и корней в холодильнике нематоды сохраняют жизнеспособность в течение многих месяцев, однако, плотность популяции их в данных субстратах может существенно изменяться. Существуют различные методы выделения нематод, ниже приводится описание некоторых из них.

3.1Методы выделения

Визуальный метод. Этим методом обследуют главным образом корневую систему растений. Отобранный материал отмывают от почвы, помещают в чашку Петри с водой и осторожно расщепляют ткани корня прочными стальными препаровальными иглами и скальпелем. Операцию проводят под бинокуляром МБС-1 или МБС-9. Из чашки Петри нематод выбирают тонкой энтомологической иглой, вмонтированной в деревянный или пластмассовый стержень и переносят в каплю фиксирующего раствора на предметное стекло с лункой. Со дна сосуда нематоду сначала подталкивают иглой к пленке поверхностного натяжения воды и затем быстрым движением кончика иглы, подведенной перпендикулярно под тело нематоды, выносят ее на воздух и опускают в приготовленную каплю чистой воды или фиксирующего раствора.

Вороночный метод (метод Бермана). Обнаружить нематод в растениях и почве можно с помощью вороночного метода. На горло воронки надевают резиновую трубку соответствующего диаметра и длиной 5-7 см. В другой конец трубки вставляют небольшую пробирку или трубку перекрывают зажимом Мора. Воронку закрепляют на штативе и помещают в нее кусок металлической или капроновой сетки с крупными ячейками, чтобы кусочки ткани не тонули и не забивали отверстие воронки. Далее воронку заполняют чистой водой до уровня несколько выше сетки. На сетку режут небольшие кусочки отмытой от почвы растительной ткани, которые предварительно взвешиваются. Это необходимо для определения численности нематод в 1 г корней. Время экспозиции тканей в воде 24 часа.

Из почвы нематод также можно выделять вороночным методом Бермана. Наиболее простой метод – это когда исследуемую почву помещают в марлевый мешочек, кладут его в воронку с чистой водой также на 24 часа. Выходящие из почвы нематоды оседают в пробирку. Однако количество нематод, выделенных данным методом, как правило, не превышает 30% и поэтому имеются различные модификации этого метода, повышающие выход нематод из почвы.Количество нематод, выделенных этими модифицированными методами, в 3-10 раз больше, чем предыдущим.

В воронку с помещенным в нее металлическим ситом кладут тонкий слой ваты толщиной 1 мм или ватный молочный фильтр, или марлю. Ватный или марлевый слой необходим для того, чтобы частички почвы не попадали в воду и не загрязняли пробу. В то же время данный слой должен быть как можно тоньше, т.к. от толщины его зависит степень прохождения нематод в воду. На ватный слой рассыпают тонким ровным слоем почву толщиной 2-5 мм. Вода должна только омачивать почву, но не покрывать ее. Заполнение воронки должно происходить таким образом, чтобы вода не попадала на почву и не омывала ее в воронку.

Необходимо отметить, чем лучше аэрация помещенных в воде частичек почвы и растительных тканей, тем более интенсивно происходит выделение из них нематод. Данный метод можно использовать при небольших пробах – менее 10 см3 почвы. Если проба почвы превышает этот объем (25, 50, 100 см3), то целесообразно использовать другую модификацию данного метода выделения нематод.

На почвенное сито с крупным диаметром ячей (возможно использование любого сита с металлической или капроновой сеткой) кладут тонкий слой ваты и рассыпают по всей поверхности почву толщиной 2-6 мм. Сито с почвой помещают в тарелку соответствующего диаметра, в которую наливают воду с таким расчетом, чтобы она не покры-вала частицы почвы. Через 24 часа воду из тарелки сливают в воронку с пробиркой на 2 часа для отстаивания нематод. Следует заметить, что указанными методами обычно наиболее полно выделяются подвижные нематоды, к которым относятся сапробиотические формы нематод обитающие в растительных остатках (представители отрядов, Rhabditida, Araeolaimida, Chromadorida) и некоторые паразитические виды отряда Tylenchida (семейства Tylenchorhynchidae, Hoplolaimidae, Pratylenchidae и др.), В то же время, ряд паразитических групп нематод (нематоды- вирусоносители, цистообразующие, кольчатые нематоды) методом Бермана фактически не выделяются. Поэтому необходимо применять метод промывки почвы. Несмотря на то, что значительное число подвижных нематод, выделяемых методом Бермана, теряется, данный метод является более универсальным, чем предыдущий, т.к. позволяет выявить более широкий спектр фауны нематод.

Промывка почвы. Промывка почвы через сито из мельничного газа позволяет выделить из нее все виды нематод. Для этой цели следует брать те же объемы почвы как и при выделении нематод методом Бермана. Образец почвы помещают в сосуд (ведро 3-5 л) и заливают водой, объем которой превышает объем взятой для анализа почвы в 5-10 и более раз. После размокания почвы она взбалтывается деревянной или стеклянной палочкой вращательным движением и быстро сливается в другой сосуд аналогичного объема. На дне и на стенах сосуда, который держится в наклонном положении; задерживаются мелкие камешки, песчинки и другие тяжелые частицы. Последние затем удаляются. Процедура эта повторяется от 3 до 10 раз в зависимости от типа и механического состава почвы. Наконец, суспензию с нематодами пропускают через сито из мельничного газа с размером ячеи 40-70 мкм (рис.4, Б). Для получения более точных данных по количественному составу нематод желательно повторное процеживание фильтрата из одной и той же пробы проводить от 3 до 5 раз. Остаток с нематодами смывают с сита раствором ТАФ или водой в чашку Петри или банку. В последнем случае нематоды фиксируются крепким формалином с расчетом получения 4-6% раствора. Для получения более качественного материала желательно остаток с нематодами подогреть перед фиксацией до 50-60° С на водяной бане или фиксировать горячим фиксатором (70°). Необходимо отметить, что в верхних слоях почвы питомников часто содержится очень много детрита (мелких органических частиц), который весьма затрудняет просмотр пробы. В этих случаях для облегчения последующей выборки нематод одну и ту же пробу следует промывать через 2-3 сита с ячейками диаметром: 1) не менее 2 мм (для листьев, веток), 2) 100-200 мкм (для крупных видов нематод) и, наконец, 3) 40-50 мкм (для всех остальных нематод) (рис.4, А). Наклон сит под углом 30-35°, а также предварительное диспергирование частиц и комков почвы за счет замачивания в воде, повышает эффективность выделения нематод.

 

Мной для выделения нематод использовался вышеописанный вороночный метод(Бермана)  и метод декантации или промывки почвы (Флегга).

 

3.2Методы учета нематод. Подсчет нематод проводят под бинокуляром в чашке Петри. Для удобства чашку Петри расчерчивают на сектора с внешней стороны. Если нематод в чашке Петри много, то считают в трех секторах, а затем устанавливают общую численность нематод в пробе.

3.3Фиксация

Фиксация предотвращает процессы разложения тканей нематод и делает возможным их долгое хранение. Наиболее распространенный фиксатор для нематод, широко используемый фитогельминтологами, это 4-6%-ый раствор формалина (формалин представляет собой водный раствор, содержащий 40% формальдегида муравьиной кислоты). Однако при длительном хранении в нем нематод, они могут становиться ломкими, а их внутренняя структура зернистой. Учитывая это, многие нематологи для фиксации используют раствор ТАФ, который по действию на нематоды является более мягким, чем формалин, поскольку триэтаноламин нейтрализует муравьиную кислоту. Состав ТАФ: формалин 7 мл, триэтаноламин 2 мл, дистиллированная вода 91 мл.

Другим фиксатором может являться смесь формалина – 10 мл, глицерина – 1 мл и дистиллированной воды – 89 мл. Данный состав может использоваться и как фиксатор, и как раствор № 1 при дальнейшем просветлении нематод (см. раздел "Просветление").

Следует заметить, что, фиксируя нематод в пробирке с водой (при выделении методом Бермана), концентрированный формалин добавляется пипеткой в таком объеме, чтобы получилась общая концентрация раствора 4-6%. В случае фиксации другими растворами необходимо отобрать из пробирки с нематодами воду на 2/3 ее объема и добавить туда до краев фиксатор (ТАФ или формалиноглицериновую смесь).

Перед фиксацией пробирку с нематодами желательно подогреть на водяной бане до 50°-60° С или, напротив, возможна добавка горячего фиксатора (70° С). При горячей фиксации раствор хорошо проникает в тело нематод и качество препаратов, как правило, улучшается.

3.4Приготовление препаратов

Препараты нематод могут быть временными и постоянными. Ниже приведены наиболее распространенные способы их приготовления.

Временные препараты. При приготовлении временного препарата необходимо в каплю воды, помещенную на предметное стекло, положить нематод (живых или фиксированных) и погрузить их на дно этой капли. Капля с нематодами накрывается покровным стеклом и объект рассматривается под микроскопом. Однако данный способ приготовления препаратов не позволяет рассмотреть ультраструктуры тела нематод видимые только при большом увеличении с применением иммерсии. Кроме того, вода через 15-20 мин. испарится и препарат испортится. Несколько увеличить срок годности такого препарата можно путем периодического добавления капель воды на край покровного стекла. Часто при просмотре под микроскопом живого материала на водном временном препарате исследователю необходимо инактивировать нематод, т.к. последние постоянно исчезают из поля зрения исследователя. Для этого надо подержать препарат несколько секунд над каким-либо нагре-вательным прибором (электроплиткой, лампочкой и т.д.). Под действием тепла (40-50° С) движения нематод прекратятся или уменьшатся.

Временные препараты используются при рекогносцировочном просмотре выделенных нематод и дают ориентировочное представление об обнаруженной фауне. Окончательную идентификацию особей можно провести только после приготовления постоянного препарата.

Приготовление постоянных препаратов. Для приготовления посто-янных препаратов нематод необходимым этапом является просветление – проводка их через спиртовые растворы с целью обезвоживания тканей.

Просветление. Наиболее признанным является метод Сайнхорота. (Подробное описание различных методов просветления нематод приводится Н.И. Суменковой, 1978). Процесс этот заключается в следующем. Готовятся два раствора: 1-ый – 96°-й этиловый спирт – 20 частей, глицерин – 1 часть, Дистиллированная вода. – 79 частей; 2-ой – 96°-й спирт – 95 частей, глицерин – 5 частей. Из фиксатора (рис. 5, А) нематод переносят на стекло с лункой в каплю 1-го раствора (рис. 5, Б). Стекло кладут в чашку Петри с ватой, обильно смоченной спиртом, закрывают ее и помещают все это в термостат при температуре 35-40° С на 12 часов. Затем в лунку с нематодами добавляют каплю 2-го раствора и открытую чашку Петри помещают снова в термостат при той же температуре на 3 часа. В заключение в лунку добавляют 1-2 капли чистого глицерина. Кроме вышеописанного метода существует более простой, но более длительный метод обезвоживания нематод, при котором получают вполне удовлетворительные результаты. Для этого нематод переносят в смесь спирта с глицерином в пропорции 1 : 1 и содержат несколько дней при комнатной температуре.