Автор работы: Пользователь скрыл имя, 20 Декабря 2013 в 01:52, курсовая работа
Метод ВЭЖХ имеет широкую область применения. С помощью него проводят качественный и количественный анализ антибиотиков различных групп, разрабатывают новые методики определения. Кроме того методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических β-лактамных антибиотиков, а также проводили анализы с полученными продуктами декструкции и окисления антибиотиков.
Доксорубицин - антибиотик широкого спектра действия. Он является антибиотиком антрациклинового ряда и обладает противоопухолевым действием.
Согласно ВФС 42-1796-88, содержание доксорубицина определяют микробиологическим методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bac.cereus var. mycoides 537 (споры), который отличается большой трудоемкостью, длительностью и неспецифичностью. Из-за недостатков микробилогического метода, доксорубицин определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Во время экспериментальной части, принимали во внимание результаты исследования хроматографической активности доксорубицина в тонких слоях нормальнофазного (пластины "Silufol UV-254") и обращеннофазного (пластины "Silufol UV-254", обработанные вазелиновым маслом) сорбентов с применением подвижных фаз различной полярности, в качестве неподвижной фазы использовали обращеннофазный сорбент "Новопак Т-18", а в качестве элюента — систему растворителей изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) в соотношении 3:7 (по объему). Определения проводили на хроматографе "Water Alian" (USA) с детектором фотодиодной матрицы на колонке размером 150x3,9 мм. Скорость подачи элюента составляла 0,7 мл/мин при температуре колонки 37°С.
На основании результатов методик определения получили, что разработанный вариант определений доксорубицина по методу ВЭЖХ, в отличие от фармакопейной (микробиологический метод диффузии в агар), характеризуется более высокой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка среднего результата (n=5;P=0,95) при определении исследуемого вещества в субстанции и лекарственных формах по предлагаемой методике в 2-2,5 раза ниже, чем при использовании фармакопейной методики. Разработанная методика упрощает процесс анализа, сокращая в 35 раз его продолжительность (с 18 ч до 30 мин) и позволяет проводить определение Доксорубицина в присутствии других компонентов лекарственных форм[3]
Также высокоэффективную жидкостную хроматографию использовали для определения противоопухолевого препарата митомицина С (ММС) в образцах ткани мочевого пузыря методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (365 нм) и масс-спектрометрическим детектированием с пределами обнаружения (отношение сигнал/шум = 3) 50 и 10 нг/мл соответственно. Образцы ткани гомогенизировали и проводили процедуру твердофазной экстракции на патроне DSC-18. Методика применена для сравнения эффективности проникновения ММС в ткань мочевого пузыря за счет пассивной диффузии и внутриполостного лекарственного электрофореза. Внутриполостной лекарственный электрофорез повышает степень проникновения митомицина в стенки мочевого пузыря в 3–5 раз по сравнению с пассивной диффузией[17].
Бициллин-3 является пенициллином пролонгированного действия и представляет собой смесь натриевой, новокаиновой и бензатиновой солей бензилпенициллина. По действующей ВФС 42-3034—98 определение бензилпенициллина в препарате проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, новокаин определяют спектрофотометрически, а бензатин экстрагируют эфиром из водного раствора, насыщенного хлоридом натрия. После выпаривания эфира бензатин определяют титрованием хлорной кислотой. В Европейской Фармакопее содержание бензилпенициллина и бензатина в бензатиновой соли бензилпенициллина определяют с помощью градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии в смеси метанола с раствором фосфата натрия при рН 3,5.
Использовали бициллин-3 производства АКО "Синтез" (Курган).
Исследование проводили на хроматографе фирмы "Waters" (США) с насосом модели 510, УФ-детектором модели 481 и инжектором модели 7125 (Rheodyne) с дозирующей петлей вместимостью 50 мкл. Для детектирования использовали длину волны 214 нм, при которой хорошо детектируются все анализируемые соединения. Регистрацию хроматограмм и расчет площадей пиков и основных параметров удерживания проводили с помощью персонального компьютера с аналого-цифровым преобразователем и программой "Мультихром".
Был изучен обращенно-фазный вариант метода ВЭЖХ на колонке "Luna С18(2)" размером 250 х 4,6 мм фирмы "Phenomenex" (США), поскольку колонка зарекомендовала себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков органических аминов. С этой же целью в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с буферным раствором, содержащим в качестве одного из компонентов триэтиламин, имеющим рН= 5,0[18].
Также с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, включающей не только стадию ферментативного синтеза, но и стадии разделения компонентов реакционной смеси.
Характеристика антибиотиков
В работе использовали образцы антибиотиков - ампициллина, амоксициллина, цефалексина, цефадроксила и цефаклора, ацилирующие агенты - метиловый эфир Д- фенилглицина и метиловый эфир п – гидрокси – Д- фенилглицина.
В качестве биокатализатора использовали иммобилизованную аминоцефалоспоринсинтетазу их Xanthomonas rubrilineans, штамм ВКМ-629[24], полученную так, как это описано в работе[11,12].
Применяли хроматограф фирмы « Waters Associates Inc.» (США) с УФ- детектором с переменной длинной волны и колонкой из нержавеющей стали, заполненной носителем « Sylasorb C18» с размером частиц 4,5 мкм. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин.
В качестве подвижной фазы использовали смеси метанола с фосфатно-аммиачным буфером 0,05М, pH 2,05 в различных соотношениях[13].
С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили качественный и количественный анализ ряда антибиотиков-гликопептидов и грамицидина S на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе Милихром А-02. Кроме того можно также проводить химическую идентификацию антибиотиков в неочищенных образцах, что важно для лабораторий, ведущих скрининг природных или полусинтетических антибиотиков[30].
При изучения условия десорбции антибиотиков группы гликопептидов, такие как: эремомицин, ванкомицин, ристомицин А и тейкопланин А2 определили, что они могут быть элюированы с ультрадисперсного углеродного сорбента при использовании органических растворителей (ТГФ, т-БС, ИП, ДМСО) в смеси с 0,5 М уксусной кислотой. Оптимальный растворитель и его концентрацию, обеспечивающую наиболее эффективную элюцию, подбирали индивидуально для каждого антибиотика. Показано, что для ристомицина А, ванкомицина и эремомицина наиболее эффективна элюирующая смесь, содержащая т-БС, а для тейкопланина А2 — TГФ. После десорбции физико-химические (молекулярная масса, УФ спектры, время удерживания при ВЭЖХ) и антимикробные свойства антибиотиков оставались неизменными[10].
При изучении антибиотиков группы рифамицины были получены продукты деструкции и окисления рифампицина, которые охарактеризованы методом ВЭЖХ и идентифицированы методом масс-спектрометрии. Изучена стабильность рифампицина в водной фазе и в составе липосом при 4 и 25 °C. Показано, что при хранении основным продуктом деструкции в липосомах является 3-формилрифамицин SV. Установлено, что антибактериальная активность антибиотика в составе липосом не отличается от его активности в водной фазе и не изменяется при хранении[22].
Для анализа двух препаратов были разработаны методики определения:
- разрабатывали методику определения антибиотика Рокситромицина в сыворотке крови методов ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием с использованием Кларитромицина в качестве внутреннего стандарта. Методику использовали для исследования фармакокинетики лекарственного препарата “Рулид”. Рокситромицин и Кларитромицин из образцов сыворотки извлекали методом твердофазной экстракции на патроне с полярным сорбентом – цианопропилсилилсиликагелем. Абсолютная степень извлечения составила 89.6 и 92.5%, соответственно. Хроматографическое разделение проводили на колонке Nucleodur C18 Isis с подвижной фазой вода–метанол– ацетонитрил–муравьиная кислота (499 : 250 : 250 : 1 по объему). Регистрировали в режиме мониторинга отдельных ионов с m/z 837.7 Рокситромицина и m/z 748.7 Кларитромицина соответственно[19].
- разрабатывали метод количественного определения азитромицина ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании "Плива", Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед[20].
С помощью метода ВЭЖХ-МС/МС определяли концентрацию антибактериальных глазных капель Сигницеф, Офтаквикс и Вигамокс в содержимом влаги передней камеры глаза (ВПКГ). В исследование включены 90 пациентов, которые были распределены на три группы по 30 человек. Пациентам первой группы закапывали 0,5% раствор моксифлоксацина (Вигамокс), пациентам второй и третьей группы 0,5% раствор левофлоксацина, соответственно, Офтаквикс и Сигницеф. Пациентам всех трех групп антибактериальные капли закапывали за один час до начала факоэмульсификации, четырехкратно по 1 капле с интервалом 15 минут. В результате, средняя концентрация глазных капель Офтаквикс и Вигамокс во ВПКГ была одинаковой и составляла, соответственно, 一 0,9 мкг/мл и 1,0 мкг/мл. В группе пациентов, которым в качестве профилактики послеоперационных осложнений назначали Сигницеф, средняя концентрация препарата равнялась -1,5 мкг/мл. Средняя концентрация всех исследуемых препаратов, которые принадлежат к фторхинолонам III-IV поколения, была в несколько раз выше, чем средняя МПК90 для выделенных от пациентов штаммов, что должно способствовать безопасному течению послеоперационного периода и профилактике инфекционных осложнений[21].
|
Метод ВЭЖХ имеет широкую область применения. С помощью него проводят качественный и количественный анализ антибиотиков различных групп, разрабатывают новые методики определения. Кроме того методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, а также проводили анализы с полученными продуктами декструкции и окисления антибиотиков. Высокоэффективная жидкостная хроматография кроме медицины используется и в пищевой промышленности, там определяют остаточное количество антибиотиков, например тетрациклина и левомицетина в сыром и пастеризованном молоке.
|