Роль моноокчида азоты в формировании кислородтранспортной функции крови

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Кафедра нормальной физиологии

 

 

 

 

 

 

на тему: «Роль монооксида азота в формировании кислородтранспортной функции крови»

 

 

 

Выполнил студент 2-го курса

лечебного факультета 10-й  группы

Шотик Павел Андреевич

 

 

 

 

 

 

 

ГРОДНО 2008

План:

 

 

• Аннотация
• L-аргинин-NO система
• NO и гемоглобин
• Значение NO-производных гемоглобина
• Особенности содержания оксида азота в крови в различных отделах сердечно-сосудистой системы
• Заключение
• Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

АННОТАЦИЯ

Анализ литературы и результаты выполненных нами исследований свидетельствуют о том, что L-аргинин-оксид азота (NO) система может участвовать в формировании кислородтранспортной функции крови. NO в реакции с гемоглобином образует метгемоглобин, нитрозилгемоглобин (HbFe²⁺NO) и S-нитрозогемоглобина  (SNO-Hb). Биологическая функция NO-производных гемоглобина достаточно широка (транспорт NO, его депонирование, элиминация и другие), они участвуют в генезе многих патологических состояний. Присутствие различных соединений гемоглобина с NO может по-разному влиять на сродство гемоглобина к кислороду (СГК) всей крови. Meтгемоглобин и SNO-Hb его повышают, а HbFe²⁺NO снижает, соответственно. Их влияние на модуляцию кислородсвязывающих свойств крови может иметь важное значение для процессов газообмена. На уровне капилляров малого круга кровообращения это может быть дополнительным механизмом, способствующим оксигенации крови, а на уровне микроциркуляции большого круга – оптимизирующим десатурацию крови, и соответственно доставку кислорода в ткани. Кислородсвязывающие свойства крови влияют на состояние L-аргинин-NO системы. В тоже время данная система может определять СГК через внутриэритроцитарные механизмы регуляции, кислородзависимый характер образования NO, регуляцию сосудистого тонуса, действие пероксинитрита.

 

L-АРГИНИН-NO СИСТЕМА

В настоящее время активно иcследуются различные аспекты биологического действия оксида азота (NO), уникальной молекулы, выполняющей роль физиологического мессенджера, а в некоторых условиях цитотоксической эффекторной молекулы. Ее образование происходит из аминокислоты L-аргинина под контролем фермента NO-синтазы в   присутствии   NADPH, кальмодулина и других кофакторов, образующих в совокупности L-аргинин-NO систему. Регуляция активности NO-синтазы идет по конечному продукту через обратную связь, NO способен связываться с гемической группой фермента, снижая тем самым его активность. В литературе вышло много обзоров, посвященных L -аргинин-NO системе (или L-arginine-NO pathway в зарубежной литературе).

Стационарная концентрация NO определяется скоростью его образования  и разложения, так как NO и его  метаболиты в существенных количествах в тканях не запасаются. Активность различных изоформ NO-синтаз колеблется в широком пределе: тип I (нейрональная) NO-синтаза имеет максимальное значение около 300, тип II (макрофагальная) – до 1000, тип III (эндотелиальная) - около 15 нмоль/мг/мин. Измерение содержания NO в просвете сосудов на различных участках сердечно-сосудистой системы показывает диапазон его изменений в пределах 0,3-1,3 мкмолей. По измерениям с помощью микроэлектродной техники установлено, что эндотелий может вырабатывать в 10-40 раз больше NO , чем это требуется для активации растворимой гемсодержащей гуанилатциклазы. В печени мышей NO продуцируется со скоростью 2 мкмоль/час/г, а в других тканях в 5-10 раз меньше. В ткани миокарда его содержание за счет синтеза эндотелиальной NO -синтазы составляет 100-300 пмоль. О бщее количество, синтезируемого NO судя по уровню NO₃ - , колеблется от 150 до 1000 мкмолей/сут. Образование NO эндотелием in situ или в культуре примерно равно 4 пмоль/кг белка/мин, что в перерасчете на общую массу эндотелия 1,5 кг для организма человека составляет 1728 мкмоль/сут. Оценка образования NO в организме (методом вдыхания стабильного изотопа кислорода ¹⁸О₂) показала, что скорость его образования составляет 0,38 ± 0,06 мкмоль/кг в час, а общее суточное количество 600-700 мкмолей. Продуктами разложения NO является нестабильный, но специфический NO₂ - и более стабильный и менее специфичный NO₃ - более 90% первого имеет эндотелиальную природу происхождения в организме человека. Для регулирования уровня NO в клетках различных тканей существуют различные механизмы, как то S-нитрозотиолы и динитрозильные комплексы негемового железа. NO количественно и функционально отличается от О₂. Для удовлетворения основных метаболических потребностей организма необходимо миллимолярные количества О₂ и наномолярные концентрации NO. В целом, дыхательный цикл можно рассматривать как систему "трех газов" (NO/О₂ /CО₂).

Активно обсуждается вопрос об альтернативных источниках образования NO. Окислительный процесс превращения  гемоглобина в метгемоглобин  под действием нитрит-ионов может  быть сопряжен с синтезом NO. Предложена концепция цикла азота, согласно которой в образовании NO имеет значение не только L-аргинин-NO система, но и нитритредуктазная система, т.е. в этом процессе восстановления важное значение имеет и активность электронно-донорных систем, участвующих в восстановлении гемоглобина. Предполагается наличие собственных механизмов синтеза NO в эритроцитах, судя по накоплению конечных продуктов его метаболизма NO₂/ NO₃, цитруллина. Обнаружено методом иммуноблоттинга наличие в эритроцитах белков типа NO-синтазы. Kang E.S. et al. показали, что нормальные циркулирующие эритроциты содержат две изоформы NO-синтаз, не обладающих в обычных условиях каталитической активностью, хотя возможно, что незрелые эритроциты (эритробласты, ретикулоциты) могли бы экспрессировать их NO-синтазную активность, утрачивая ее по мере дифференциации. В этом аспекте дискуссируется вопрос о значении существования в эритроцитах собственного источника NO (NO-синтазного или нитрит-гемоглобинового). Учитывая сложную природу участия NO в обеспечении различных функций организма, должны существовать эффективные механизмы регуляции его уровня в тех или иных процессах.

 

NO И ГЕМОГЛОБИН

Молекула гемоглобина состоит из двух a- и двух b-полипептидных цепей, каждая из которых связана с гемической группой, содержащей порфириновое кольцо и атом Fe²⁺, способный обратимо связывать 1 молекулу О₂. Глобиновые субъединицы дезоксигемоглобина тесно удерживаются электростатическими связями в плотной Т-конформации со сравнительно низким сродством к О₂ . Присоединение О₂ разрывает эти электростатические связи, ведя к релаксированной R-конформации, в которой остальные связывающиеся участки молекулы гемоглобина имеют сродство к О₂ в 500 раз выше, чем в Т-конформации. Эти изменения ведут к кооперативности между связывающими участками так, что присоединение одной молекулы О₂ с дезоксигемоглобином повышает сродство к нему остальных связывающих участков на этой же молекуле. В организме СГК в значительной степени определяет диффузию кислорода из альвеолярного воздуха в кровь, а затем на уровне капилляров в ткань. Свойство гемоглобина обратимо связывать кислород, является частным случаем общей закономерности взаимодействия протеинов с лигандами. Представляет интерес изучение взаимодействия гемоглобина с NO , так как он имеет гораздо более высокое сродство к гемической группе дезоксигемоглобина, чем О₂ и CO, что позволяет предполагать его конкурирование с кислородом за соответствующие участки на молекулах частично оксигенированного гемоглобина.

Взаимодействие NO с гемоглобином в эритроцитах важно для регуляции  обеих этих молекул in vivo . Существующие свойства эритроцитов не ограничивают взаимодействие гемоглобина с NO в  физиологических условиях, не только не разрушая его биоактивность, но и  сохраняя ее. На модели кишечника, в  которой создавалась окклюзия верхней  брыжеечной артерии и оценивалось образование HbFe²⁺NO и диэтилдиокарбаната с железом, показано, что NO , высвобождаемый из эндотелиальных клеток диффундирует, прежде всего, не в ткань, а в кровь. При внутриартериальном введении крысам динитрозильных комплексов железа в крови регистрировали сигнал ЭПР парамагнитного мононитрозильного комплекса, локализованного в основном (до 90%) в форменных элементах крови. В плазме в отличие от цельной крови NO превращается в нитрат довольно не эффективно, что указывает на активное участие форменных элементов крови в его метаболизме. Реакция NO с гемической группой гемоглобина может быть частично ограничена гидрофобным компонентом клеточной мембраны, лимитируя процесс его диффузии в эритроцит. NO переносится через клеточную мембрану посредством специального переносчика протеина AE1, или анион-обменник. Проницаемость эритроцитарной мембраны для NO сравнительно невысока, что может иметь значение для его биодоступности, реакции NO с гемоглобином. Предполагается существование цитоскелетного барьера для диффузии NO , реализуемого через особые межбелковые бреши (поры) в эритроцитарной мембране, состояние некоторых регулируемо, и соответственно изменяет вход NO. Скорость реакции гемоглобина с NO, находящегося в эритроцитах, в 800 раз меньше, нежели с эквивалентным количеством свободного гемоглобина. В тоже время показано, что клеточная мембрана эритроцитов не является существенным барьером для NO и его производных и не лимитирует его взаимодействие с гемоглобином. Мембрана эритроцитов рассматривается как некий специализированный насос для NO. Она имеет два компартмента для гемоглобина и активно регулирует транспорт NO из клетки: один находится внутри, а другой – на мембране. Регулируемый кислородом клеточный механизм сопряжения синтеза и экспорта биоактивности NO, образуемого гемоглобином, действует через мембранный механизм (комплекс АЕ1-SNO). Критическими факторами, определяющими скорость захвата NO эритроцитами, является ориентация мембранных молекул и внутриклеточное перераспределение гемоглобина.

В артериальной крови NO в  реакции с оксигемоглобином образует нитрат и метгемоглобин, а в венозной - нитрозилгемоглобин (HbFe²⁺ NO), способный при высоких рО₂ распадаться с высвобождением молекулы NO, которая окисляется в присутствии кислорода до NO^3- [80]. Гемоглобин взаимодействует с NO через высокоаффинные Fe²⁺-связывающие участки на геме, его сродство к NO в 8000 раз выше, чем к О₂. HbFe²⁺NO имеет шестикоординатную форму гемических групп. Спектр ЭПР HbFe²⁺ NO в растворе является суперпозицией спектров T- и R -конформеров гемоглобина с преимущественным образованием Т-формы, которые обусловлены обратимыми переходами от сильного (R) до слабого (Т) взаимодействия Fe²⁺-гем с проксимальным гистидином. Нитрозилгемоглобин характеризуется выраженным эффектом Бора, что может иметь особенно важное значение при ацидозе. Указывается на возможность реагирования HbFe²⁺ NO с O₂ - с образованием аддукта гема с ONOO^- и последующим образовании NO^3-.

Существуют и другие физиологические  механизмы связывания циркулирующего в крови NO. Недавно было установлен участок в   глобиновой цепи гемоглобина, в котором NO связывается в форме S-нитрозотиола, а именно S-нитрозогемоглобина (SNO-Hb). Масс-спектрометрические и кристаллографические данные однозначно идентифицировали   b93-цистеин как место связывания NO с гемоглобином. При очень больших концентрациях нитрозотиолов in vitro образуются и другие формы SNO - Hb , у которых нитрозилируется аминокислота цистеин в положении 12 и 104 b- и a-белковых цепей, соответственно. NO, образуемый in vitro при добавлении индуцибельной изоформы NO-синтазы к эритроцитам, может превращать содержащийся в них гемоглобин в SNO-Hb. Кислородсвязывающие свойства SNO-Hb сильно зависят от pH (величина эффекта Бора для него близка к обычному гемоглобину). Протонирование соответствующих аминокислот (b146-гистидина и b93-цистеина) взаимосвязано, что может способствовать высвобождению NO. S-нитрозилирование гемоглобина облегчает отсоединение NO с гема и поступление его к гипоксическим тканям. SNO-Hb выступает в роли акцептора или донора е^- , внося тем самым вклад в редокс-равновесие гема, однако значение этих функций минимально в условиях покоя.

Перенос NO от S-нитрозотиола на гемоглобин регулируется аллостерически и функционально связан с присоединением О₂. По мере связывания гемоглобина с О₂ в лёгких его сродство для S-нитрозотиола растёт, а при отдаче снижается, благодаря чему NO высвобождается в ткани. Существует О₂-зависимое равновесие между SNO-Hb и HbFe²⁺NO (при отсутствии низкомолекулярных тиолов вроде цистеина, мишенью NO является гем с Fe 2+ , а в его присутствии следует перенос NO-группы на цистеиновый остаток b-глобина). Положение редокс-равновесия между SNO-Hb и HbFe²⁺ NO связано с аллостерическим состоянием гемоглобина. После дезоксигенации большая доля SNO-HbO₂ превращается в HbFe²⁺ NO. Дезоксигенация облегчает как реакцию транснитрозирования, в которой получаются вазорелаксирующие нитрозотиолы, так и восстановительную реакцию запасания NO, образующую нитрозилгемоглобин.

 

HbFe²⁺ NO + 4О₂ àSNO-Hb(О₂)₄ + e^–

 

Артериовенозное распределение HbFe²⁺NO обратно пропорционально SNO-Hb, т.е. большие концентрации нитрозильного гемоглобина обнаруживаются в деоксигенированной крови, и наоборот. Существует цикл связывания О₂ и NO в легких и их высвобождения на периферии. SH-группа S-нитрозотиола существенно защищает NO от гашения присоединением к гему. Равновесие между HbFe²⁺NO и SNO-Hb связано с конформацией белка: образование SNO-Hb облегчается в R-структуре, а HbFe²⁺NO преимущественно образуется в Т. Высвобождению NO из тиолов способствуют дезоксигенация и окисление гема (Т-структура, высокоспиновая); что согласуется с термодинамическими особенностями его связывания. Первичным аддуктом гемоглобина и NO , образуемого при дыхании NO, у нормальных индивидуумов является HbFe²⁺NO и в небольшом количестве SNO-Hb. SNO-Hb также находится в равновесии с низкомолекулярными нитрозотиолами. Гидроксимочевина реагирует с различными формами гемоглобина, образуя до 6% HbFe²⁺NO и не образовывая SNO-Hb.

Глутатион может влиять на равновесие SNO-Hb и HbFe²⁺ NO , что может влиять на процессы оксигенации и деоксигенации крови в капиллярах малого и большого кругов кровообращения. NO, высвобождаемый из SNO - Hb в присутствии глутатиона, не вызывает заметных сосудистых эффектов в изолированном легком в связи с быстрым окислением NO и образования метгемоглобина. Главным продуктом взаимодействия GSH с SNO-Hb in vivo, вероятно, является HbFe²⁺NO, за счет чего происходит модификация СГК, сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо.

 

SNO-Hb(О₂) +GSH + e^– « HbFe²⁺NO + GS^- + О₂

 

Анализируя взаимодействие in vivo NO с Hb предполагается следующие  соотношения между реакциями, ведущими к образованию NO-производных: метгемоглобин и NO₃ + >>> HbFe₂ + NO > SNO-Hb, хотя другие авторы указывают на более высокое содержание HbFe²⁺ NO и SNO-Hb, преобладающее над уровнем метгемоглобина. Связывание NO с оксигемоглобином является кооперативным, его окисление в метгемоглобин при физиологических условиях ограничено и преобладают реакции, ведущие к усиленному образованию HbFe²⁺NO. Исследование реакции с NO и гемоглобином, ведущих к образованию метгемоглобина, далеко не всегда доминируют в условиях in vivo. Взаимодействие NO с HbO₂ не уничтожает его активность, а более того, обеспечивает его сохранение («гемоглобин рационально вводит новую химию, когда его насыщение кислородом высоко, лимитируя окисление NO и сохраняя его биоактивность»).

 

ЗНАЧЕНИЕ NO-ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА