Полимеразная цепная реакция

 

 

 

 

Министерство образования  и науки Российской Федерации 
 
 
 

 

Реферат по дисциплине: Микробиология

 

Тема: Полимеразная цепная реакция

 

 

 

 

 

                                                    Автор:  
                                                     
                                                   Преподаватель:  
 
 
 
 
 
 
2013

 

Содержание

1. Полимеразная цепная реакция (стр.1-2)

2. Принцип метода  полимеразной цепной реакции (стр.3)

2.1 Наличие в реакционной  смеси ряда компонентов(стр.4)

2.2 Циклический температурный  режим(стр.5-6)

2.3 Основные принципы  подбора праймеров (стр.7)

2.4 Эффект "плато" (стр.8)

3. Cтадии постановки ПЦР (стр.9)

3.1 Подготовка пробы  биологического материала (стр.9)

3.2 Амплификация (стр.10)

3.3 Оценка результатов  реакции (стр.11)

3.3.1 Метод горизонтального  электрофореза (стр.12)

3.3.2 Метод вертикального  электрофореза (стр.13)

3.4 Контроль за прохождением реакции амплификации (стр.14-15)

3.4.1 Положительные  контроли (стр.14-15)

3.4.2 Внутренние контроли(стр.14-15)

4. Методы, основанные  на полимеразной цепной реакции (стр.16)

4.1 Качественный  анализ (стр.16)

4.1.1 Способ постановки  ПЦР с использованием “горячего  старта" (стр.17)

4.1.2 Детекция молекул РНК (стр.18)

5. Организация технологического  процесса постановки ПЦР (стр.19)

Заключение (стр.20)

 

 

 

1.Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 

Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последнее десятилетие. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

Впервые состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь  для постановки полимеразной цепной реакции, и основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны Клеппе с соавтором в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции.

В 1983 году Кэри Мулис предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллиарды раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

В этот период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры  горячих источников и сохраняет  свою биологическую активность вплоть до 95° С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное  практическое применение метода.

 

 

 

 

1

Перспективы практического  использования ПЦР-диагностики

В настоящее время  наиболее быстро развиваются пять основных направлений генодиагностики:

диагностика инфекционных заболеваний;

диагностика онкологических заболеваний;

диагностика лейкемий и лимфом;

диагностика рака груди;

диагностика других злокачественных заболеваний;

диагностика генетических заболеваний;

идентификация личности;

судебная медицина, криминалистика;

трансплантация  органов и тканей;

определение отцовства;

диагностика патогенов в пище.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

2.Принцип метода полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий: 
 
Наличие в реакционной смеси ряда компонентов; 
Циклический температурный режим; 
Соблюдение основные принципов подбора праймеров; 
Контроль эффекта «плато» 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

 2.1Наличие в реакционной смеси ряда компонентов 

Праймеры - пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;

Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия  для реакции, а также стабильное значение рН;

Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную  смесь препарат, который может  содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного  копирования (например, ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический  продукт амплификации не образуется.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

2.2 Циклический температурный режим

Если в анализируемом  образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит  из трех этапов.

1. Денатурация. На  первом этапе необходимо денатурировать  ДНК, находящуюся в образце.  Для этого реакционную смесь  нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты.

2. Отжиг. На втором  этапе температуру смеси понижают  до 55°С праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в  соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца праймера.

3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру  в реакционной смеси доводят  до оптимума работы Taq-полимеразы - 75°С, и начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’-гидроксильной группой праймера, с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров к температуре оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухстадийный цикл ПЦР, совместив две стадии - отжиг и элонгацию - в одной.

В дальнейшем этапы  денатурации, отжига и элонгации  многократно повторяются (30 и более  раз). На каждом цикле количество синтезированных  копий фрагмента ДНК удваивается.

Фактически значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет, по некоторым  данным, 78-97%. В случае присутствия  в пробе ингибиторов реакции  это значение может быть намного  меньше.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его  поддержание осуществляется автоматически. Каждый цикл обычно длится 3 - 5 минут.

5

Первый цикл. ДНК-мишень фланкирована определенными последовательностями. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’-гидроксильной группы "её" праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют "длинными матрецами", именно на них будет идти дальнейший синтез. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

Во втором цикле  двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ("длинная матрица") цепей, вновь денатурируют, а затем отжигают с праймерами. При отжиге праймеры гобридизуются с комплементарными им участками как исходных цепей, так и "длинных матриц", синтезированных в первом цикле. В результате ферментативного синтеза на исходных цепях синтезируются "длинные матрицы", а на "длинных матрицах" - "короткие", с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймер, на другом.

В третьем цикле  все гетеродуплуксы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также "длинных" и "коротких" матриц. При ферментативном синтезе in vitro на исходных цепях синтезируются "длинные матрицы", а на "длинных" и "коротких" матрицах - только "короткие матрицы".

В послудующих циклах число "коротких матриц" становится все больше.

Таким образом, специфические  фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

2.3 Основные принципы подбора праймеров

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3’-концам праймеров, т.к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т.к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

2.4 Эффект «плато»

Следует заметить, что процесс накопления специфических  продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность  критически падает. Это связано с  так называемым эффектом "плато".

Термин эффект “плато”  используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости от условий и количества циклов реакции  амплификации, на момент достижения эффекта  “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная  концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на “плато". Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов  амплификации будет достаточно, чтобы  их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

3. Cтадии постановки ПЦР

 
 3.1Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК  используют различные методики в  зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и  удалении или нейтрализации посторонних  примесей для получения препарата  ДНК с чистотой, пригодной для  постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей  уже классической считается методика получения чистого препарата  ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. 
Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. 
Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.