Основы генной инженерии

План:

 

1. Основы генной инженерии и её роль:

1. Материальная основа наследственности бактерий.

2. Основы изменчивости бактерий.
3. Генетика вирусов.
4. Механизмы образования лекарственной устойчивости бактерий.
5. Генная инженерия в медицинской микробиологии.

2. Получение и использование вакцины и сыворотки:

1. Определение вакцины.
2. Получение и использование вакцины.
3. Определение сыворотки.
4. Получение и использование сыворотки.

 

I. Основы генной инженерии и её роль:

 

1. Материальная основа наследственности бактерий

 

Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех организмов, в том числе бактерии и вирусы, является молекула ДНК. Исключение составляют только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК.

 

Рис. 1. Материальная основа наследственности - ДНК (у вирусов может быть и РНК).

 

Прокариотический геном

У бактерий обычно имеется одна замкнутая  хромосома, содержащая до 4000 отдельных  генов, необходимых для поддержания  жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна.

 

Рис. 2. Геном бактерий - нуклеоид в виде ДНК расходится к дочерним клеткам при делении (темно окрашенные элементы внутри клетки) (электронная микрофотография, окрашивание искусственное).

Внехромосомные факторы наследственности

Внехромосомные факторы наследственности бактерий представлены плазмидами, вставочными последовательностями и транспозонами.

Плазмиды

Плазмиды – фрагменты ДНК (от 40 до 50 генов). Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.

Выделяют следующие группы плазмид.

F-плазмиды. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) c бактериями-реципиентами (F–).

R-плазмиды (от англ. resistance, устойчивость) кодируют устойчивость к лекарственным препаратам.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование (плазмиды включают tox+-гены).

Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов.

 

2. Основы изменчивости бактерий

 

Модификации

Модификации – фенотипические изменения  какого-либо признака или нескольких признаков микроорганизмов. Модификации  проявляются в изменении морфологических, биохимических и других признаков  с последующей их реверсией к  первоначальному фенотипу после  устранения действия фактора, вызвавшего их образование.

            Мутации

Мутация - изменение первичной структуры  ДНК, проявляющееся наследственно  закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. Факторы, вызывающие мутации, известны как мутагены.

К появлению спонтанных мутаций  приводят ошибки репликации, неправильное формирование пар оснований или  структурные искажения ДНК под  действием естественных мутагенов.

Индуцированные мутации получают под влиянием каких-либо мутагенов (химические вещества, излучение, температура  и др.) в эксперименте. По количеству мутировавших генов различают генные и хромосомные мутации.

Генетические рекомбинации

Бактерии способны обмениваться генетическим материалом и, по аналогии с половым  размножением, давать начало потомству  с новыми свойствами. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих  родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства, или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смешением генов. Известны три способа получения рекомбинантов: путем трансформации, трансдукции и конъюгации.

 

3. Генетика вирусов

 

Патогенные для человека вирусы обладают двумя основными свойствами - наследственностью и изменчивостью.

Модификации у многих вирусов проявляются  изменением химического состава  внешней оболочки вириона, связанного с включением в его состав липидов  и углеводов тех клеток хозяина, в которых происходила их репродукция.

Мутации. Спонтанные мутации у вирусов  возникают во время репликации их нуклеиновых кислот. Они затрагивают  различные свойства вирусов.

Индуцированные мутации возникают  под действием тех же химических и физических мутагенов, которые  вызывают мутации у бактерий.

Рекомбинации происходят при одновременном  заражении двумя вирусами чувствительной к ним клетки хозяина.

При генетической рекомбинации происходит обмен отдельными генами между двумя  и более вирусами в фонде реплицирующейся  ДНК, образуются рекомбинанты, содержащие гены двух и более родителей (вирус гриппа).

 

4. Механизмы образования лекарственной устойчивости микроорганизмов

 

Существует два типа лекарственной  устойчивости бактерий: естественная, или природная, и приобретенная.

Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком. Она  присуща всем представителям данного  вида и не зависит от первичного контакта (контактов) с данным антибиотиком, в ее основе нет никаких специфических  механизмов.

Приобретенная лекарственная резистентность возникает у отдельных представителей данного вида бактерий только в результате изменения ее генома. Возможны два варианта генетических изменений. Один из них связан с мутациями в тех или иных генах бактериальной хромосомы, вследствие которых продукт атакуемого гена перестает быть мишенью для данного антибиотика. Это происходит либо вследствие изменения структуры белка, либо потому, что он становится недоступным для антибиотика.

В другом случае бактерии становятся устойчивыми к антибиотику или  даже сразу к нескольким антибиотикам благодаря приобретению дополнительных генов, носителями которых являются R-плазмиды. Решающую роль в распространении лекарственной устойчивости, в том числе множественной, играют R-плазмиды благодаря способности их к самопереносу.

 

5. Генная инженерия в медицинской микробиологии

 

Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с конструированием несуществующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов.

Метод генетической инженерии относится  к числу перспективнейших при  получении многих белковых биологических  веществ, представляющих ценность для  медицины. Этим методом получены: интерфероны, интерлейкины, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадки почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и другие.

С помощью генной инженерии создаются  препараты второго поколения, т.е. аналоги природных веществ, обладающих большей эффективностью действия.

 

 

 

        II. Получение и использование вакцины и сыворотки

 

1. Определение вакцины

 

Вакцины (Vaccines) - препараты, предназначенные для создания активного иммунитета в организме привитых людей или животных. Основным действующим началом каждой вакцины является иммуноген, т. е. корпускулярная или растворенная субстанция, несущая на себе химические структуры, аналогичные компонентам возбудителя заболевания, ответственным за выработку иммунитета.

В зависимости от природы иммуногена вакцины подразделяются на:

1. цельномикробные или цельновирионные, состоящие из микроорганизмов, соответственно бактерий или вирусов, сохраняющих в процессе изготовления свою целостность;

2. химические вакцины из продуктов  жизнедеятельности микроорганизма (классический пример - анатоксины) или его интегральных компонентов,  т.н. субмикробные или субвирионные вакцины;

3. генно-инженерные вакцины, содержащие  продукты экспрессии отдельных  генов микроорганизма, наработанные  в специальных клеточных системах;

4. химерные, или векторные вакцины, в которых ген, контролирующий синтез протективного белка, встроен в безвредный микроорганизм в расчете на то, что синтез этого белка будет происходить в организме привитого и, наконец,

5. синтетические вакцины, где  в качестве иммуногена используется  химический аналог протективного белка, полученный методом прямого химического синтеза.

В свою очередь среди цельномикробных (цельновирионных) вакцин выделяют инактивированные, или убитые, и живые аттенуированные. У первых возможность проявления патогенных свойств микроорганизма надежно устраняется за счет химической, термальной или иной обработки микробной (вирусной) взвеси, другими словами, умерщвления возбудителя болезни при сохранении его иммунизирующей активности; у вторых - за счет глубоких и стабильных изменений в геноме микроорганизма, исключающих вероятность возвращения к вирулентному фенотипу, т.е. реверсии. Эффективность живых вакцин определяется в конечном счете способностью аттенуированного микроорганизма размножаться в организме привитого, воспроизводя иммунологически активные компоненты непосредственно в его тканях. При использовании убитых вакцин иммунизирующий эффект зависит от количества иммуногена, вводимого в составе препарата, поэтому с целью создания более полноценных иммуногенных стимулов приходится прибегать к концентрации и очистке микробных клеток или вирусных частиц. Иммунизирующую способность инактивированных и всех других нереплицирующихся вакцин удается повысить путем сорбции иммуногена на крупномолекулярных химически инертных полимерах, добавления адъювантов, т. е. веществ, стимулирующих иммунные реакции организма, а также заключения иммуногена в мельчайшие капсулы, которые медленно рассасываются, способствуя депонированию вакцины в месте введения и пролонгированию, тем самым, действия иммуногенных стимулов.

 

 

Компоненты вакцин

Как известно, основу каждой вакцины  составляют протективные антигены, представляющие собой лишь небольшую часть бактериальной клетки или вируса и обеспечивающие развитие специфического иммунного ответа.

Протективные антигены могут являться белками, гликопротеидами, липополисахаридобелковыми комплексами. Они могут быть связаны с микробными клетками (коклюшная палочка, стрептококки и др.), секретироваться ими (бактериальные токсины), а у вирусов располагаются преимущественно в поверхностных слоях суперкапсида вириона.

В состав вакцины, кроме основного  действующего начала, могут входить  и другие компоненты - сорбент, консервант, наполнитель, стабилизатор и неспецифические  примеси. К последним могут быть отнесены белки субстрата культивирования вирусных вакцин, следовое* количество антибиотика и белка сыворотки животных, используемых в ряде случаев при культивировании клеточных культур.

(* - следовым называется количество  вещества, неопределяемое современными  методиками). Консерванты входят  в состав вакцин, производимых  во всем мире.

Их назначение состоит в обеспечении  стерильности препаратов в тех случаях, когда возникают условия для  бактериальной контаминации (появление  микротрещин при транспортировке, хранение вскрытой первичной многодозной упаковки). Указание о необходимости наличия консервантов содержится в рекомендациях ВОЗ. Что касается веществ, используемых в качестве стабилизаторов и наполнителей, то в производстве вакцин используются те из них, которые допущены для введения в организм человека.

 

2. Получение и использование вакцины

 

Вакцинация и ревакцинация

Вакцинация бывает как однократной (корь, паротит, туберкулез), так и  многократной (полиомиелит, АКДС). Кратность  говорит о том, сколько раз  необходимо получить вакцину для  образования иммунитета.

Ревакцинация - мероприятие, направленное на поддержание иммунитета, выработанного предыдущими вакцинациями. Обычно проводится через несколько лет после вакцинации.

Эффективность вакцинации

Поствакцинационный иммунитет - иммунитет, который развивается после введения вакцины. Вакцинация не всегда бывает эффективной. Вакцины теряют свои качества при неправильном хранении. Но даже если условия хранения соблюдались, всегда существует вероятность, что иммунитет не простимулируется.

На развитие поствакцинального иммунитета влияют следующие факторы:

1.Зависящие от самой вакцины: