Основы генной инженерии

 

Одним из важнейших прикладных направлений развития молекулярной биологии является генная инженерия.

Генная инженерия представляет собой высокотехнологичный процесс  переноса гена (ДНК) одного организма в другой организм с целью получения его продукта (белка).

Организмы, в которые переносятся чужеродные гены, называется трансгенными.

В литературе генная инженерия  также называется клонированием гена, ДНК-рекомбинантной технологией, генным манипулированием и др.

Исследования в области генной инженерии были начаты в 70-е гг.XX века. В 1982г. Управление по санитарному контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США выдало первый патент на производство генно-инженерном способом важнейшего белка – гормона инсулина. А эти же годы генно-инженерная технология была применена для получения противовирусного препарата – интерферона, путем введения в бактериальную клетку трех генов, контролирующих его синтез.

В настоящее время генная инженерия широко применяется в  медицине для диагностики и установления механизмов развития наследственных болезней, злокачественных опухолей, судебной медицине и криминалистике, фармацевтической промышленности для синтеза и  производства лекарственных средств  в т.ч. вакцин; микробиологии, для получения полезных человеку штампов микроорганизмов, сельском хозяйстве, для получения трансгенных животных и растений с ценными для человека свойствами, клонирования клеток, органов и целых организмов.

Предпосылками к проведению генно-инженерных исследований являются:

1.Создание  функционально активных рекомбинантных ДНК, способных к переносу в другие организмы. Рекомбинаторной ДНК называется целостная структура,  состоящая из молекулы (гена) ДНК,  отобранной по определенным, полезным свойствам, и молекулы  ДНК (векторная ДНК), обладающей способностью проникать в другие клетки.

2.Разработка методов  переноса рекомбинантных ДНК  в подходящую клетку.

3.Создание условий для  функционирования отобранного гена, введенного в клетку.

 Генно-инженерный технологический процесс состоит из следующих этапов:

1.Выбор организма и  его гена, обладающего определенными, полезными организма, искусственно синтезирован химическим путем, синтезирован на молекуле и-РНК с помощью фермента обратной транскриптазы.

2.Выбор подходящего  переносчика или вектора гена.

3.Обработка клонируемого  гена и вектора одинаковым  рестриктазами.

4.Сшивание вектора и  встроенного в него гена с  помощью ДНК-лигазы с образованием  рекомбинатной ДНК.

5.Подбор организма (клетки) – реципиента, в который переносится рекомбинатная ДНК.

6.Введение рекомбинатной  ДНК в реципиентную клетку.

7.Обеспечение оптимальных  условий для роста и размножения  клеток – реципиентов (клонируемых генов).

8.Выделение в чистом  виде продукта (белка) клонируемого  гена.

9.Промышленное производство  и реализация лекарственных средств,  гормонов, витаминов, внедрение в сельское хозяйство и пищевую промышленность трансгенных растений, животных, продуктов питания.

Генно-инженерный технологический  процесс начинается с расщепления  исследуемой молекулы ДНК на небольшие  фрагменты, каждая из которых содержит 1 или несколько генов, которые  необходимо проклонировать и экспрессировать.

1.Выбор организма и  гена для клонирования

                                                                                                   

 

       ген               Обработка рестриктазой                                                            фрагмент ДНК  

2.Выбор переносчика  (вектора) гена

                          

                                                      Плазмида (кольцевая молекула ДНК)

 

                                          Обработка растиктазой

 

 

 

 

 

 

3.Встраивание и сшивание  клонируемого гена в плазмиде

                Плазмиада

                                      Встроенный ген  

 

 

4.Перенос  плазмиды с геном в клетку-реципиент (например, кишечную палочку, E coli)

                                         Плазмида

 

 

                                        Бактериальная ДНК 

 

 

Затем каждый из этих фрагментоув по одному сшивается со специальной вирусоподобной частицей ДНК (плазмидой) обладющей способностью самореплицироваться. Эти вирусоподобные, рекомбинатные молекулы ДНК переносятся в быстроделящиеся клетки (хозяйские клетки). Каждая клетка-хозяин  (бактериальная или дрожжевая) превращается в таким образом в фабрику по клонированию гена.

Генно-индженерный технологический  процесс  заканчивается выделением  в чистом виде и промышленным производством  продукта гена – белка, представляющего  собой витамин, гормон, фактор устойчивости, антитело и т.д.

В качестве реципиентов, в  геном которых встраивается клонируемы гены, используются бактериальные клетки, клетки  культуры тканей, эмбриональные  клетки млекопитающих, дрозофилы; у  растений – протопласты, изолированные  клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши.

Рекомбинантную ДНК  вводят в клетку – реципиент путем:

-микроиньекции тонкими  стеклянными микрошприцами (диаметр  0,1-0,5мкм) ;

-электрокорпорации, основанной  на воздействии импульсами  высокого  напряжения, обратимо обратимо увеличивающими  проиницаемость билмембран.

-трансфекции или встраивания  чужеродной ДНК в культивируемые  эукаритические клетки  после  обработки их изолированной ДНК  в присуствии в среде ионов  кальция;

-упаковки в липосомы  для защиты клонируемого гена  от действия нуклеазных ферментов  реципиента. Липосомы представляют собой сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов, внутри которых располагается  рекомбинантная ДНК. Клетки организма – реципиента захватывают липосомы и содержащиеся в них трансгены.

-бомбардировки «генными  пушками» клеток – реципиентов  микрочастицами золота или вольфрама,  на которые наносят ДНК   вектора вместе  с трансгеном. Микрочастицы золота или вольфрама, содержащие клонируемый ген, проникает в клетку и ядро клетки – реципиента. Ген встраивается в геном клетки иначинает клонироваться.

В процессе генной инженерии  используется ряд ферментов: эндонуклеазы,  обратные транскриптазы, ДНК – полимераза, щелочная фофатаза и др.

В качестве переносчиков генов  или векторов клонирования используются плазмиды, бактериофаги, космиды и фазмиды. У высших организмов, в т.ч. у человека, в качестве переносчиков генов используется плазмиды, а мобильные элементы (транспозоны-«прыгающие гены» - участки ДНК, способные перемещатся из одного локуса в другой в пределах одной хромосомы или из одной хромосомы в другую). Плазмиды представляют собой кольцевые, автономно реплицирующиеся молекулы ДНК.

Использования плазмид  в качестве переносчиков связано  с особыми свойствами, которыми они  обладают:

1.Гены плазмид не  являются абсолютно влажными  для их жизнедеятельности, поэтому  плазмиды обладают способностью  покидать одну бактериальную  клетку и проникать другую, перенося  таким образом генетические признаки (гены) из одной клетки в другую.

2.Плазмиды размножаются  внутри бактериальной клетки  автономно (независимо) от бактериальной  ДНК.

3.Плазмиды могут встраиваться  в ДНК бактерии и в ходе  их перемещения в другую клетку переносят участки молекулы хозяйской (бактеирльной) ДНК. В периоде это свойство плазмид импользуется в качестве эффективного способа обмена генами между бактериальными клетками ( Nossal Coppel, 1989)

Копийная или комплементарная  ДНК (кДНК) предстаавляет собой молекулу ДНК, полученую путем ее обратного синтеза на молекуле и-РНК.

 

         и-РНК                          

                      Добавление олтгопраймера (dT)

 

         и-РНК                     AAAAAn

 

 

Обратная транскрипция

 

и-РНК                                         AAAAAn

               Гибридная молекула и-РНК – кДНК

к-ДНК                                       ТТ ТТ n

                       Обработка щелочью 

                       для удаления РНК

к-ДНК   Молекула к-ДНК        ТТ ТТ n

                    

 Репликация ДНК

     

                                              

 

к-ДНК   2-я молекула к-ДНК   ТТ ТТ n

                    

Молекулы  к-ДНК связываются  с подходящим вектором (переносчико), проникают в бактериальную клетку, трансформируют ее, не нарушая нормального  функционирования клетки.

Трансформированная бактериальная  клетка, содержит плазмиду со встроенной в нее ДНК, называемую клональной (к) ДНК.

Полная коллекция фпагментов клонированной ДНК охватывает весь геном организма. Она носит название банка генов или геномной библиотеки (Dahl et al 1981).

Геномная библиотека создается  в экспериментах, в которых геном  клетки клонируется в виде случайных  фрагментов с неизвестной последовательностью  нуклеотидов.

Клонированная ДНК получается в результате технологических процессов  вкл в себя:

1)клонирования отдельных  фрагментов ДНК;

2)присоединения фрагментов  ДНК к подходящему вектору  (обычно это фаг);

3)внедрение рекомбинированной ДНК в клетку-хозяин с целью получения высоко эффективным способом большого количества различных клонов.

4)отбор нужных клонов.

5)использование клонов  для создания геномного банка.

Для  расшифровки нуклеотидной последовательности неизвестной ДНК (гена) и последующей диагностики инфекционных болезней, идентификации пищевых загрязнителей, судебно-медицинской экспертизы используются молекулярные зонды. Молекулярные зонды представляют собой фрагмент одноцепочечной нуклеиновой кислоты (длиной 20-40 нуклеотидов), меченной радиоактивной изотопом (Р) или нерадиоактивными соединениями  (биотин или диоксигенин). Последовательность  нуклеотидов в зонде должна быть  комплиментарной по крайней мере части исследуемой ДНК.

В качестве молекулярных зондов используются частично очищенная и  РНК, синтезированный химическим путем олигонуклеотид, которые способны идентифицировать соответствующую рекомбинантную ДНК.

Современные достижения и перспективы развития генной инженерии.

Принцип получения в  промышленных условиях и масштабах биологически активных белков генно-инженерным способом сводится к созданию рекомбинантного штамма бактерий, способного синтезировать целевой продукт (гормон, антиген и т,д.), выращиванию в производственных условиях  рекомбинантного штамма; выделению из биомассы рекомбинатного штама целевого продукта, его очистке, концентрированию и приданию ему лекарственной формы.

С помощью генной инженерии  было получено сотни и тысячи рекомбинантных штаммов в бактерий и вирусов, способных синтезировать продукты (белки) генов, встроенных в из геномы.

Таким образом уже получены штаммы рекомбинантных бактерий и вирусов (кишечная палоска, псевдомонады, дрожжи, вирусы), способных синтезировать гормоны человека (инсулин, гормон роста), антигены вирусов гепатита В, ВИЧ, возбудителей малярии, коклюша, бешенства, кори, сифилиса и др.; ферменты (липазы, протеазы), иммуномодуляторы (интерфероны, интерлейкины, пептиды тимуса, костного мозга, фактор некроса опухоли), белки крови (альбумин, комплемент, антикоагулянты, тромболитики), рецепторы клеток, регуляторыне петиды, управляющие нервной, иммунной и другими системами.

Для медицины биотехнологическая промышленность производит антибиотики, витамины, ферменты, аминокислоты, гормоны, вакцины, антитела, компоненты крови, алкалоиды, пищевые белки, нуклеиновые кислоты, липиды, антиметаболиты, антиоксиданты, противоопухолевые, противоглистные  препараты и др.

В сельском хозяйстве  получены трансгенные растения,  устойчивые к действию гербицидов, патогенных грибов, вредных насекомых, обладающие способностью к ускоренному росту, продолжительному хранению, характеризирующиеся высокой урожайностью и качеством. В частности получены трансгенные растения, устойчивые к действию гербицидов – глифосфату. производным хлорсульфанови имидазолинов, фосфинотропину, даламону и др.