Методы определения качества антибиотиков - аминогликозидов

Государственное бюджетное образовательное  учреждение высшего профессионального  образования «Курский государственный  медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации 

(ГБОУ  ВПО КГМУ Минздрава России)

 

Факультет: фармацевтический

Форма обучения: заочная

 

КУРСОВАЯ  РАБОТА

по фармацевтической химии

 

Тема:

МЕТОДЫ  ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА

 

 АНТИБИОТИКОВ-АМИНОГЛИКОЗИДОВ

 

Исполнитель: Рябова Марина Владимировна,

6 курс, 5 группа, з/к №572

Обратный адрес:

141207 Московская обл., г.Пушкино,  ул. Писаревский проезд, д.3.кв.62

 

Дата отправки работы «       »____________2013 г.

Оценка__________________

Дата  проверки «        »_____________________ 20___г.

Преподаватель:_________________________   _______________________

                                              Подпись                       Ф.И.О.

 

 

Курск – 2013

 

СОДЕРЖАНИЕ

      Стр.

ВВЕДЕНИЕ          3

ГЛАВА 1. Антибиотики-аминогликозиды как 

лекарственные средства        4

ГЛАВА 2. Установление подлинности антибиотиков

из группы аминогликозидов       10

ГЛАВА 3.Испытания на чистоту        17

ГЛАВА 4.Количественное определение  антибиотиков –

аминогликозидов         19

ЗАКЛЮЧЕНИЕ          21

ЛИТЕРАТУРА          22

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

С момента открытия стрептомицина  и до настоящего времени, аминогликозиды сохраняют свое значение как эффективные средства лечения инфекций, вызываемых преимущественно грамотрицательными микроорганизмами. Практическая значимость аминогликозидов обусловлена широким спектром антибактериального действия и активностью против микобактерий. Новые аминогликозиды высокоэффективны в отношении синегнойной палочки и других неферментирующих грамотрицательных бактерий [18].

Аминогликозиды - группа антибиотиков, в структуре которых  имеется так называемая гликозидная  связь. Они угнетают в микробной клетке синтез белка, препятствуя размножению бактерий, а в более высоких концентрациях - разрушают цитоплазматические мембраны и убивают клетку. После открытия стрептомицина (первое этиотропное средство лечения туберкулеза) была получена целая группа антибиотиков, родственных по строению и сходных по механизму действия и противомикробным свойствам. В эту группу входят амикацин, гентамицин, нетилмицин, сизомицин, тобрамицин, канамицин и другие. Наиболее широко их применяют при инфекциях, вызванных грамотрицательными бактериями кишечной группы, особенно при бактериемии, сепсисе, эндокардите.

Успешное применение аминогликозидов возможно лишь при строгом контроле их качества. Экспрессное количественное определение антибиотиков в биологических жидкостях и лекарственных формах необходимо для оценки физиологических и биохимических процессов, протекающих в организме. [1,8,10]

 

ГЛАВА 1.

Антибиотики-аминогликозиды как лекарственные средства

 

Аминогликозиды получили свое название в связи с наличием в молекуле аминосахаридов, соединенных гликозидной связью с агликоновым фрагментом. Антибиотики этой группы продуцируют лучистые грибы Actinomyces (неомицин, канамицин, тобрамицин), Streptomyces (стрептомицин), Micromonospora (гентамицин и др.). Некоторые аминогликозиды получают синтетически (так, амикацин является производным канамицина А и готовится из него).

Все антибиотики этой группы имеют широкий спектр действия, вызывая стаз или убивая многие грамположительные  и особенно грамотрицательные бактерии. В относительно малых концентрациях они связывают 30S субъединицу рибосомы микробной клетки и останавливают синтез белка (вызывают бактериостаз), в больших — нарушают проницаемость и барьерные функции цитоплазматических мембран (бактерицидный эффект).

Отдельные препараты различаются по активности, спектру и длительности действия. Все антибиотики-аминогликозиды обладают характерными токсическими свойствами — нефротоксичностью и особенно ототоксичностью (кохлеарной и вестибулярной).

Основное клиническое  значение аминогликозиды имеют при лечении нозокомиальных инфекций, вызванных аэробными грамотрицательными возбудителями, а также инфекционного эндокардита. Стрептомицин и канамицин используют при лечении туберкулеза. Неомицин как наиболее токсичный среди аминогликозидов применяется только внутрь и местно [16].

Выделяют три  поколения аминогликозидов [1].

I-е: стрептомицин, неомицин (колимицин), канамицин. Стрептомицин  сохраняет свое значение в  лечении туберкулеза, в терапевтической  практике еще применяется канамицин.

II-е поколение - гентамицин (гарамицин).

III-е поколение: тобрамицин, сизомицин, амикацин.

По степени убывания антимикробного действия аминогликозиды располагаются следующим образом: амикацин > гентамицин > тобрамицин > стрептомицин > канамицин.

Все аминогликозиды содержат в своей структуре шестичленное кольцо циклического аминоспирта - агликон, который связан с аминосодержащими и аминонесодержащими сахарами гликозидной связью [2,3,19]. Агликон стрептомицина - стрептидин представляет собой 1,3-дигуанидино-2,4,5,6-тетраоксициклогексан или спирт инозит, в котором две оксигруппы замещены остатками гуанидина:

   

Другие аминогликозиды содержат в качестве агликона 2-дезоксистрептамин (1,3-диамино-4,5,6-тригидроксициклогексан) [2,3,17,19].

Стрептомицин – один из основных представителей антибиотиков-аминогликозидов. Он был впервые описан в 1944 г. американским ученым З. Ваксманом. По структуре стрептомицин может быть рассмотрен как гликозид – N-метил-α-L-глюкозамино-β-L-стрептозидо-стрептидин.

 

СТРЕПТОМИЦИНА СУЛЬФАТ

Streptomycini sulfas

Ме = метильный радикал

Сахарная часть стрептомицина  представляет собой стрептобиозамин, построенный из связанных между  собой остатков N-метил-L-глюкозамина и L-стрептозы.

N-метил-L-глюкозамин   L-стрептоза

 

Группа антибиотиков- канамицинов включает канамицин  А, канамицин В и канамицин  С. Наименьшую токсичность проявляет  канамицин А, поэтому он составляет основную массу (94%) канамицина сульфата.

 

КАНАМИЦИНА СУЛЬФАТ

Kanamycini sulfas

В структуру канамицина А входят сахара 3-амино-3-дезокси-D-глюкоза (канозамин) и 6-амино-6-дезокси-D-глюкоза:

                6-амино-6-дезокси-D-глюкоза       3-амино-3-дезокси-D-глюкоза

 

Полусинтетическим аналогом, получаемым из канамицина А, является амикацин, который в медицинской практике применяется в виде сульфата. Основное его структурное отличие от канамицина заключается в наличии 4-амино-L-2-оксибутирильного радикала.

АМИКАЦИНА СУЛЬФАТ

Amikacini sulfas

 

С канамицином сходен антибиотик гентамицин. Он включает смесь трех антибиотиков - гентамицинов С ₁ , С ₂ и С _{1 a} .

ГЕНТАМИЦИНА СУЛЬФАТ

Gentamycini sulfas

 

Гентамицин С₁    R₁ = R₂ = CH₃;

Гентамицин С₂   R₁ = CH₃ ;  R₂ = H;

Гентамицин С_1а  R₁ = R₂ = H

Аминогликозиды являются органическими основаниями и  образуют соли с кислотами посредством  аминогрупп. Стрептомицин, например, является трехкислотным основанием за счет двух сильно основных гуанидиновых групп и более слабой метиламиногруппы. Основание канамицина содержит 4 основных центра (две аминогруппы в агликоне 2-дезоксистрептамине, а также аминогруппы в сахарах). Основание гентамицина содержит 5 основных центров: 2 аминогруппы в агликоне, 3 аминогруппы в сахарных остатках [17,19].

Стрептомицина сульфат - порошок или пористая масса белого или почти белого цвета, без запаха, горьковатая на вкус; гигроскопичен. Легко растворим в воде, практически  нерастворим в спирте, хлороформе и эфире. Устойчив в слабокислой среде, но легко разрушается в растворах крепких кислот и щелочей при нагревании. Канамицина сульфат  - белый кристаллический порошок без запаха и вкуса. Легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте. Устойчив в растворах щелочей. Амикацина сульфат – это аморфный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета. Легко растворим в воде. Гигроскопичен. Гентамицина сульфат – это белый порошок или пористая масса с кремоватым оттенком. Легко растворим в воде, практически не растворим в спирте [2,3,5,11,12,13].

 

 

ГЛАВА 2.

Установление  подлинности антибиотиков из группы аминогликозидов

Поскольку канамицина и  гентамицина сульфаты являются смесями  нескольких веществ, для испытания  их подлинности используют метод  ТСХ с закрепленным слоем сорбента. Хроматограмму канамицина проявляют нингидрином, а гентамицина – парами йода и сравнивают с хроматограммами стандартных образцов. Метод ТСХ на закрепленном слое силикагеля КСК №2 используют для установления подлинности амикацина сульфата (проявитель раствор нингидрина) [2,3,12,19 ].

ТСХ для стрептомицина  сульфата выполняют на пластинках со слоем силикагеля Н (содержащего  карбомер) при сравнении с ГСО  стрептомицина сульфата. Пятна проявляют  опрыскиванием раствором нафталин-1.3-диола [2].

Для разделения и идентификации основных компонентов гентамицина гентамицинов С₁, С₂ и С_1а используют бумажную или тонкослойную хроматографию в системе растворителей хлороформ – метанол – 17% водный раствор аммония гидроксида (2:1:1). К числу других аналогичных систем растворителей для бумажной хроматографии гентамицинов относятся смеси хлороформ-метанол-аммиак различного состава и бутанон-2-трет-бутанол-метанол-концентрированный гидроксид аммония (16:3:1:6) [2,3,12]

Для установления подлинности  стрептомицина сульфата, применяемого в качестве стандарта при биологическом контроле, используют ПМР-спектроскопию. Спектр ПМР должен соответствовать рисунку спектра, прилагаемому к фармакопейной статье [2,3]. ПМР-спектроскопию применяют для идентификации антибиотиков аминогликозидов: канамицина А, неомицина В, гентамицина, мономицина А, тобрамицина и сизомицина. Наличие в слабых полях ПМР-спектров дуплетных сигналов аномерных протонов углеводных фрагментов и сигналов, характерных для циклитолов, является общим для всей этой группы. Каждый из указанных антибиотиков имеет характерные сигналы поглощения, соответствующие определенным структурным фрагментам молекул. Однозначная связь спектральных параметров ПМР с химической и структурной природой молекул позволяет устанавливать подлинность каждого из антибиотиков в отсутствии образца –свидетеля [17,19].

Спектроскопию ЯМР ¹³С используют для идентификации тобрамицина,  стрептомицина, канамицина А и амикацина [7].

Для разделения и идентификации канамицинов были использованы методы электрофореза, ГЖХ и ВЭЖХ [3].

Лекарственные вещества из группы аминогликозидов оптически  активны, так как содержат остатки D- или L- сахаров. В нормативной документации нормируется значение удельного вращения антибиотиков-аминогликозидов [5,12,19].

Аминогликозиды не имеют характерных максимумов поглощения в УФ-области спектра. Для испытания на подлинность аминогликозидов используют ИК-спектроскопию [19].

Все лекарственные средства из группы аминогликозидов подвергаются гидролитическоме расщеплению в  кислой среде с образованием агликона и сахаров [2,3,17,19]. Так, при кислотном гидролизе канамицина образуются агликон 2-дезоксистрептамин и сахара: 6-амино-6-деокси-D-глюкоза и 3-амино-3-деокси-D-глюкоза:

 

После кислотного гидролиза аминогликозиды дают реакции на сахара: с реактивом Фелинга, Толленса, Биала, Молиша, Несслера и др.[2,3,5,17,19]

Например, при идентификации  канамицина один из его сахаров 6-глюкозамин в кислой среде превращается в 5-аминометилфурфурол, который конденсируется с орцином (тест Биала). Последующее окисление обусловливает появление зеленого окрашивания [2,3,17,19]:

С реактивами Фелинга и Толленка сахара, полученные в результате гидролиза  аминогликозидов, окисляются до соответствующих кислот. В результате образуется кирпично-красный осадок оксида меди (I)или образуется серебряное зеркало (реактив Толленса):

N-метил-L-глюкозамин

6-амино-6-деокси-D-глюкоза

 

Стрептоза в составе  стрептомицина содержит в своей  структуре свободную альдегидную  группу и окисляется реактивами Фелинга, Толленса или Несслера без предварительно гидролиза. Например, при взаимодействии с реактивом Несслера образуется бурое окрашивание вследствие восстановления металлической ртути [19]:

Из-за наличия альдегидной  группы в остатке стрептозы стрептомицин образует гидразоны, оксимы, основания  Шиффа.

2,4-динитрофенилгидразон

Реакция образования  мальтола специфична для обнаружения L-стрептозы в составе стрептомицина сульфата. В основе реакции лежит превращение остатка L-стрептозы под действием щелочи в производное пирана – мальтол. Наличие в молекуле мальтола енольного гидроксила и карбонильной группы позволяет получить окрашенный в фиолетовый цвет комплекс с железа (III) хлоридом [2,3,5,12,13 ].