Методы исследования гемостаза

Методы исследования гемостаза.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ сосудисто-тромбоцитарного гемостаза  
Выбор методов оценки сосудисто-тромбоцитарного гемостаза зависит в первую очередь от:  
•клинической картины заболевания  
•склонности больного к кровотечениям или тромбозам  
Существуют тесты оценки первичного гемостаза:  
•основные (базисные)  
•дополнительные  
Ниже приведено описание наиболее распространенных базисных методов исследования.  
1. Резистентность (ломкость) капилляров  
Манжеточная проба Румпель-Лееде-Кончаловского  
Манжету для измерения АД накладывают на плечо, создавая в ней постоянное давление, равное 100 мм рт. ст. Через 5 минут оценивают результаты пробы: 
•при отсутствии нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза ниже манжеты появляется лишь небольшое количество петехиальных (мелкоточечных) кровоизлияний - менее 10 петехий в зоне, ограниченной окружностью диаметром 5 см 
•при повышении проницаемости сосудов или тромбоцитопении число петехий в этой зоне превышает 10 - положительная проба 
2. Время кровотечения  
Многочисленные модификации теста основаны на точном измерении длительности кровотечения из ранки на мочке уха, мякоти ногтевой фаланги пальца руки или верхней трети ладонной поверхности предплечья.  
2.1 Метод Дьюка  
Стерильным скарификатором или плоским ланцетом прокалывают нижний валик мочки уха (глубина прокола 3,5—4 мм) и включают секундомер. Предварительно мочку уха согревают между пальцами. Выступающие капли крови каждые 30 с промокают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к ранке. Как только наступит момент, когда новые капли крови не образуются, выключают секундомер и определяют общую длительность кровотечения, а также оценивают размеры капель. 
!!! В норме время кровотечения по Дьюку не превышает 4 мин. Его увеличение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях или/и тяжелых нарушениях их функции (тромбоцитопатиях). Следует помнить также, что у 60% больных с этой патологией тест оказывается отрицательным, и время кровотечения нормально.  
2.2 Метод Айви  
Несколько более чувствительным является тест Айви, когда оценивают время кровотечения из надрезов на коже ладонной поверхности верхней трети предплечья на фоне искусственного повышения венозного давления с помощью манжеты для определения АД, в которой поддерживают давление 40 мм рт. ст. По ходу предплечья прикладывают соответствующий шаблон и скальпелем делают два надреза длиной 9 мм и глубиной 1 мм. Засекают время. Не касаясь надрезов, осторожно промакивают кровь фильтровальной бумагой каждые 30с до остановки кровотечения в обеих ранках. Рассчитывают среднее время по двум надрезам. В норме время кровотечения по Айви не превышает 8 минут.  
Референтные значения 
В норме время кровотечения составляет 3-6 мин (СИ: 3-6 мин) при использовании метода шаблона 3-6 мин при оценке по Айви (СИ: 3-6 мин) 1-3 мин (СИ: 1-3 мин) при оценке по Дьюку. 
3. Подсчет числа тромбоцитов  
Наибольшее распространение в настоящее время получили три метода подсчета тромбоцитов в крови:  
•подсчет в камере Горяева  
•подсчет в мазках крови 
•электронно-автоматический метод  
3.1 Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева  
Является самым точным, но достаточно трудоемким. Подсчет тромбоцитов в 1 л проводится по стандартной методике с учетом разведения крови и объема большого квадрата счетной сетки Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа для лучшего контрастирования тромбоцитов.  
Исследуемую кровь разводят в 200 раз раствором аммония оксалата или раствором, содержащим кокаина гидрохлорид, натрия хлорид, фурациллин и дистиллированную воду. Разведенную кровь перемешивают и оставляют на 30 минут для гемолиза эритроцитов. Затем заполняют камеру Горяева и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Практически для расчета количества тромбоцитов в 1 л крови число сосчитанных в 25 больших квадратах кровяных пластинах умножают на 2х106.  
3.2 Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови основан на подсчете числа тромбоцитов на 1000 эритроцитов с последующим пересчетом на 1 л крови.  
Кровь смешивают с раствором магнезии сульфата или ЭДТА. Мазки готовят на предметных стеклах и окрашивают их по Романовскому-Гимзе. В каждом поле зрения микроскопа подсчитывают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Зная число эритроцитов в 1 л крови, рассчитывают количество тромбоцитов в этом объеме.  
3.3 Автоматический метод подсчета тромбоцитов с использованием современных электронных приборов значительно облегчает и ускоряет исследование, в связи с чем находит в последние годы все большее распространение в клинической практике.  
4. Ретракция сгустка крови  
В клинической практике чаще используют непрямые методы оценки ретракции сгустка. Один из них заключается в определении объема сыворотки, выделяемой при ретракции сгустка крови, по отношению к объему плазмы исследуемой крови.  
В градуированную центрифужную пробирку набирают 5 мл крови, опускают в нее деревянную палочку и помещают пробирку в водяную баню. В исследуемой крови определяют показатель гематокрита. Через 1 ч после свертывания крови сгусток, прикрепившийся к палочке, удаляют, дав жидкой части стечь обратно в пробирку. Далее измеряют объем жидкости, оставшейся в пробирке, центрифугируют ее при 3000 об/мин в течение 5 минут и измеряют объем осевших эритроцитов. Искомый объем сыворотки определяют по разнице между объемом оставшейся в пробирке жидкости и объемом эритроцитов.  
Ретракцию сгустка рассчитывают по формуле:  
Ретракция сгустка = ОС/ОП; 
где ОС — объем сыворотки после ретракции сгустка  
ОП — объем плазмы перед началом исследования  
Объем плазмы можно определить следующим образом:  
ОП = ОК х (100 - Ht)/100 
где ОК — объем исследуемой крови  
Ht — гематокрит  
Объем сыворотки крови после ретракции сгустка всегда меньше объема плазмы перед началом исследования, так как часть жидкой части крови остается в сгустке. Чем больше сокращается сгусток, тем больше в пробирке образуется сыворотки, и наоборот.  
В норме ретракция сгустка составляет 40—95%. Ее уменьшение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях и тромбастении Гланцмана. 
5. Определение ретенции (адгезивности) тромбоцитов  
Среди многочисленных методов определения адгезивности тромбоцитов наибольшее распространение получил метод определения ретенции на стеклянных шариках. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в венозной крови до и после ее пропускания с определенной скоростью через стандартную колонку со стеклянными шариками.  
Для исследования берут свежевзятую цитратную кровь. В полиэтиленовый или силиконированный стеклянный шприц набирают 2 мл крови, присоединяют к нему полихлорвиниловую трубку (колонку) со стеклянными шариками диаметром 0,2–0,4 мм и устанавливают шприц в инфузионный насос, позволяющий опорожнять шприц со скоростью 2 мл в минуту. Количество тромбоцитов определяют дважды: до и после пропускания крови через колонку со стеклянными шариками.  
Индекс ретенции (адгезивности) тромбоцитов рассчитывают по следующей формуле:  
ИР = (А-В/А)х100(%),  
где ИР — индекс ретенции (адгезивности) 
А — количество тромбоцитов в крови до пропускания 
В — количество тромбоцитов в крови после пропускания через колонку  
У здоровых людей индекс ретенции составляет 20–55%. Уменьшение этого показателя свидетельствует о нарушении адгезии тромбоцитов и встречается при многих врожденных тромбоцитопатиях (тромбастения Гланцмана, болезнь Бернара-Сулье, болезнь Виллебранда и др.).  
6. Исследование агрегации тромбоцитов  
Представление об агрегационной способности тромбоцитов можно составить с помощью:  
6.1 Качественных методов (общее ориентировочное представление об агрегационной активности) - основанны на визуальном определении тромбоцитарных агрегатов, образующихся при смешивании тромбоцитарной плазмы с различными, чаще естественными, стимуляторами агрегации.  
•в пробирке - макроскопический метод  
•на предметном стекле - микроскопический метод по А. С. Шитиковой  
В качестве стимуляторов агрегации используют растворы АДФ, тромбина, адреналина, коллагена, ристомицина. Регистрируют время образования крупных агрегатов тромбоцитов, которое в норме обычно не превышает 10–60 с. 
6.2 Количественная фотометрическая или спектрофотометрическая регистрация процесса агрегации с помощью агрегографов различной конструкции - наиболее полная оценка агрегационной способности тромбоцитов.  
Методы заключаются в графической регистрации изменения оптической плотности тромбоцитарной плазмы при перемешивании ее со стимуляторами агрегации. Образование тромбоцитарных агрегатов ведет к увеличению светопропускающей способности тромбоцитарной плазмы. 
Полученные агрегатограммы анализируют по нескольким количественным параметрам:  
•по времени начала агрегации после добавления соответствующего стимулятора  
•по амплитуде агрегатограммы на 2-й и 6-й минутах 
•по общей площади агрегатограммы и др.  
В зависимости от используемого стимулятора и его дозы агрегатограмма может иметь различную форму:  
•при использовании в качестве стимуляторов агрегации тромбоцитов коллагена, тромбина, ристомицина регистрируют одну большую волну агрегации 
•при добавлении к тромбоцитарной плазме малых доз АДФ — двухволновую агрегатограмму 
На агрегатограммах, полученных при использовании в качестве стимулятора малых доз АДФ:  
•первая волна регистрируемой кривой отражает начальную агрегацию тромбоцитов, обусловленную введением извне стимулятора этого процесса 
•вторая волна связана с реакцией высвобождения из тромбоцитов собственных биологически активных веществ (адреналина, АДФ, тромбоксана А2 и др.), которые усиливают начавшуюся агрегацию кровяных пластинок  
!!! Отсутствие на агрегатограммах, полученных при использовании в качестве стимулятора малых доз АДФ, второй волны агрегации свидетельствует об уменьшении в тромбоцитах гранул, содержащих биологически активные вещества (недостаточность пула хранения), или о нарушении реакции высвобождения этих веществ из тромбоцитов. 

ВРЕМЯ СВЕРТЫВАНИЯ – глобальный тест, характеризующий свертывающую систему крови в целом, но малочувствительный. Так он не изменяется даже при явных расстройствах коагуляции, например при умеренной гемофилии. Годится только для контроля гепаринотерапии. В норме 8 мин именьше. 
 
ТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ТВ) характеризует состояние конечного этапа процесса свертывания крови и нарушается при гипо- и дисфибриногенемиях, ДВС-синдромах, лечении гепарином, гирудином и тромболитиками. 
 
ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ПВ) характеризует процесс свертывания при запуске его по “внешнему” механизму, что достигается добавлением к исследуемой цитратной плазме хлорида кальция и тромбопластина. Коагуляпионная активность тромбопластина тестируется на смешанном образце нормальной плазмы и не должна превышать 15 с. Лишь в специальных исследованиях (например, при выявлении волчаночного антикоагулянта) используется так называемый ослабленный тромбопластин активностью в 25-30 с. В отечественной литературе долгое время использовался расчет протромбинового индекса по формуле: 
 
 
 
При использовании этой формулы маскируется исходная активность использованного тромбопластина, не учитывается его чувствительность к дефициту факторов протромбинового комплекса, которая в современных диагностических наборах маркируется как индекс чувствительности – ISI и INR. При этом используется следующий новый расчет протромбинового отношения (ПО): 
 
 
 
Этот принятый в настоящее время расчет особенно важен для правильного дозирования антикоагулянтов непрямого действия (кумаринов, фенилина). При профилактическом приеме этих препаратов ПО поддерживают в пределах 2-2,5, при лечебном – в пределах 2,5-4. Угроза развития геморрагических осложнений возрастает по мере повышения ПО. Значительного повышения ПО (более 3,5) следует избегать в старческом возрасте, при наличии артериальной гипертонии (угроза кровоизлияния в мозг), при болезнях печени и при заболеваниях, создающих предрасположенность к кровотечениям. При нормальном тромбиновом времени замедление свертывания в протромбиновом тесте может быть обусловлено нарушением печеночного синтеза факторов VII, X, V и II при патологии печени, использованием антикоагулянтов непрямого действия, а также дефицитом витамина К, при механической (обтурационной) желтухе. 
 
АКТИВИРОВАННОЕ ЧАСТИЧНОЕ (ПАРЦИАЛЬНОЕ) ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ (АЧТВ или АПТВ). Тест воспроизводит свертывание по “внутреннему” пути. К рекальцифицированной плазме добавляются каолин и кефалин. В силу этого тест становится точным, воспроизводимым, высокочувствительным к дефициту факторов, участвующих во “внутреннем” механизме свертывания (факторов VIII, IX, XI). При дефиците этих факторов АПТВ удлиняется при остающихся нормальными ПВ и ТВ, что особенно характерно для гемофилии и болезни Виллебранда. При геморрагической болезни новорожденных, тяжелых заболеваниях печени, механической желтухе, лечении антикоагулянтами непрямого действия (кумарины, фенилин) нарушаются как АПТВ, так и ПВ при нормальном ТВ, а при лечении гепарином и тромболитиками – все три теста (табл. 7.2). 
 
Таблица 7.2. Коагуляционные тесты при дефиците факторов свертывания. 
 
 
 
РАЗДЕЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ.Дальнейшее уточнение механизмов нарушения свертываемости крови проводится с помощью дифференцирующих тестов. Все они основаны на принципе коррекции, т.е. на определении того фактора, при добавлении которого выявленные нарушения устраняются. Для этого используются входящие в диагностические наборы образцы плазмы с известным дефицитом того или иного фактора свертывания, а также коррекционные пробы с адсорбированной сернокислым барием нормальной плазмой, которая лишена фактора IX, но содержит фактор VIII, и с нормальной сывороткой нескольких дней хранения (в ней имеется фактор IX, но нет фактора VIII). 
 
Дополнительно разграничение дефицита факторов VII, X и II может быть осуществлено с помощью проб с экзогенными коагулазами из змеиных ядов (табл. 7.3). 
 
Таблица 7.3. Показания ядовых и протромбинового тестов при дефиците различных факторов свертывания крови. 
 
 
 
Количественное определение факторов свертывания осуществляется функциональными (коагуляционными, с расщеплением хромогенных субстратов) и иммунологическими тестами, которые выявляют и аномальные, нефункционирующие, факторы свертывания. 
 
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНОГО ЗВЕНА. Включает в себя определение активности антитромбина III и его гепарин-кофакторного действия, протеинов С и S, а также антигенов этих ингибиторов свертывания и альфа-2-макроглобулина. Определяют также чувствительность плазмы больного с наклонностью к тромбозам и активированному протеину С: при тромбофилии, обусловленной аномалией фактора V, активированный протеин С намного слабее удлиняет АПТВ, чем в норме. 
 
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИБРИНОЛИЗА включает в себя определение содержания в плазме продуктов расщепления фибриногена и фибрина (ПДФ), оценку спонтанного лизиса кровяного сгустка и лизиса эуглобулиновой фракции плазмы, в которой сохраняются плазминоген и его активаторы, но отсутствуют (по условиям обработки плазмы) антиплазмины. Дополнительно исследуют эуглобулиновый лизис при активации фактора XII (Хагемана) каолином, т.е. запуске фибринолиза по “внутреннему” механизму. Исследование эуглобулинового лизиса до и после пережатия сосудов плеча манжетой в течение 15-20 мин при 80 мм рт. ст. или при пережатии их в течение 3 мин при давлении выше максимального АД выявляет способность эндотелия продуцировать и выделять в кровь тканевый активатор плазминогена. 
 
Исследование фибринолиза, как и свертывания крови, может проводиться и на хромогенных субстратах. 
 
МАРКЕРЫ ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И ФИБРИНОЛИЗА. При внутрисосудистой активации системы гемостаза выявляют следующие сдвиги:

• укорачивается жизнь тромбоцитов и уменьшается в большей или меньшей степени их количество (тромбоцитопения потребления);

• увеличивается содержание в плазме веществ, выделяемых тромбоцитами в процессе “реакции высвобождения” (бета-тромбоглобулин, тромбоцитарный фактор 4);

• возрастает спонтанная агрегация тромбоцитов;

• активируются и “потребляются” факторы свертывания крови, физиологические антикоагулянты и компоненты системы фибринолиза, вследствие чего нарушаются показания общих коагуляционных тестов (коагулопатия потребления), повышается содержание продуктов расщепления факторов – фибринопептида А и В, фрагментов 1 и 2 протромбина;

• выявляются в большом количестве в плазме и сыворотке крови растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК), определяемые тестами с этанолом, протаминсульфатом, ортофенантролином; тестом склеивания стафилококков. Из этих тестов наиболее информативен и отражает количество и динамику РФМК в плазме больного ортофенантролиновый тест;

• повышается содержание в плазме ранних и поздних продуктов фибринолиза. Особое значение имеет определение содержания в плазме фибрин-мономеров, фибринопептида А (признаки тромбинемии) и конечного продукта фибринолиза – Д-димера. Повышенный уровень последнего говорит о том, что имеются как тромбинемия, в результате чего в сосудах содержится фибрин, так и активный фибринолиз, что ведет к образованию Д-димера. Значительное повышение уровня Д-димера (определяется иммунологически) важный маркер массивного тромбоза магистральных вен и тромбоэмболии легочной артерии;

• образуются новые антигенные маркеры, связанные с формированием комплексов “тромбин – антитромбин III”, “плазмин – антиплазмин”;

• возникает феномен повреждения и фрагментации эритроцитов, выявляемый при микроскопии и по расслоению этих клеток в градиенте плотности.