Методы иммобилизации ферментов

Методы иммобилизации ферментов

Существует два  основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент  не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на  нерастворимых носителях;

- включение в  поры геля;

- пространственное  отделение фермента от остального  объема реакционной системы с  помощью полупроницаемой перегородки  (мембраны);

- включение в  двухфазную среду, где фермент  растворим и может находиться только в одной из фаз.

Адсорбционная иммобилизация  является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается  при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.

Некоторых из перечисленных  затруднений можно избежать при  иммобилизации ферментов путем  включения в гели.

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобили-зации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Применение  иммобилизованныхферментов

Особенно ощутимый вклад иммобилизованные ферменты внесли в тонкий органический синтез, в  анализ, в медицину, в процессы конверсии  энергии, в пищевую и фармацевтическую промышленности.

В будущем важную роль в контроле окружающей среды  и в клинической диагностике  должны сыграть такие методы, как  биолюминесцентный анализ и иммуноферментный анализ.

В медицине иммобилизованные ферменты открыли путь к созданию лекарственных препаратов пролонгированного  действия со сниженной токсичностью и аллергенностью. Иммобилизационные подходы способствуют решению проблемы направленного транспорта лекарств в организме.

Промышленные процессы с применением иммобилизованных ферментов внедрены прежде всего в пищевую и фармацевтическую промышленность. В пищевой промышленности с участием иммобилизованных ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.

В медицине иммобилизованные ферменты используются также как  лекарственные препараты, особенно в тех случаях, когда необходимо локальное воздействие. Кроме того, биокатализаторы широко используются в различных аппаратах для  перфузионной очистки различных биологических жидкостей. Возможности и перспективы использования в медицине ферментов в иммобилизованном состоянии гораздо шире, чем достигнутые на сегодняшний день, именно на этом пути медицину ждет создание новых высокоэффективных методов лечения.

Иммобилизация клеток

В 70-х годах XX века появились первые публикации об иммобилизации  клеток микроорганизмов, а первое промышленное применение иммобилизованных клеток было осуществлено в Японии в 1974 г. С их помощью получали аспарагиновую  кислоту.

Иммобилизованные  клетки имеют ряд преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:

• отсутствие затрат на выделение и очистку ферментов;
• снижение затрат на выделение и очистку продуктов реакции;
• более высокая активность и стабильность;
• возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов;
• способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов.

Для иммобилизации  могут быть использованы клетки в  различном состоянии: живые и  поврежденные в различной степени. Одностадийные реакции могут  осуществлять и живые, и поврежденные клетки. Полиферментные реакции проводят с применением живых клеток, которые могут длительное время регенерировать АТФ и коферменты (НАДФ, НАД).

Проблема использования  ферментативной активности иммобилизованных микроорганизмов имеет глубокие корни. Более 150 лет назад быстрый  способ получения уксуса был основан  на применении микроорганизмов, адсорбированных  на древесной стружке. Методы иммобилизации  клеток схожи с методами иммобилизации  ферментов.

В литературе описано получение адсорбционным  способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя.

Наиболее часто для  иммобилизации используются такие  полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы.