Методика микроскопического анализа

Методика микроскопического анализа.

Микроскопический' анализ основан на определении признаков анатомического строения и обычно применяется для исследования резаного и порошкообразного лекарственного сырья. Цель микроскопического анализа — установить подлинность сырья. Для этого рассматриваемый объект помещают на предметное стекло микроскопа в капле жидкости и накрывают покровным стеклом. Каждый препарат рассматривают сначала при малом увеличении для общей ориентировки, а для детального анализа — при большом увеличении.

Жидкости, применяемые для изготовления микропрепарата,  называются включающими. Они имеют разное назначение и делятся на две группы: индифферентные и просветляющие.

Индифферентные жидкости — это вода, глицерин, масло, просветляющие — раствор хлоралгидрата, растворы КОН и NaOH.

Индифферентные жидкости, не реагируя с исследуемым сырьем, служат средой для его рассмотрения. Вода применяется 'для ориентировочного исследования, она не изменяет форму и окраску клеток. В воде хорошо просматриваются крахмальные зерна и включения оксалата кальция, но в ней растворяется слизь и распадаются алейроновые зерна, жирное масло собирается в более крупные капли.  

По сравнению с водой в глицерине препараты не высыхают и могут сохраняться несколько дней. Он относится к слабопросветляющим жидкостям, так как при его продолжительном воздействии ткани становятся более прозрачными.

Масло применяют для наблюдения растворимых в воде веществ.

Просветляющие жидкости. Их назначение — сделать препарат более прозрачным. Лучшей просветляющей жидкостью является раствор хлоралгидрата. При, его воздействии воздух из препарата вытесняется, крахмальные зерна разбухают и расплываются; жирные и эфирные масла растворяются; белковые вещества, хлорофилл, смолы и другие включения разрушаются; темноокрашенные оболочки светлеют; без изменения остаются включения оксалата кальция. Так как хлоралгидрат действует медленно, препарат рекомендуется осторожно подогреть, но не кипятить.

Действие растворов КОН и NaOH в различных концентрациях (от 5 до 15%) сходно с действием хлоралгидрата: крахмальные зерна разбухают и быстрее превращаются в клейстер, жиры при нагревании омыляются.

Техника приготовления временных микропрепаратов

Техника приготовления микропрепаратов зависит от состояния, в котором находится сырье (цельное, резаное, порошкообразное), и от принадлежности его к определенной морфологической группе (кора, подземный орган, лист). Чтобы выяснить анатомическое строение цельного сырья, его необходимо предварительно подготовить. Это достигается холодным размачиванием, кипячением, размягчением в водяных парах во влажной камере. Чаще применяют метод холодного размачивания, рекомендуемый для всех органов растения. Он состоит в том, что используемое сырье помещают в банку или чашку с жидкостью (2 ч воды и 11 ч глицерина), куда добавляют кристаллик карболовой кислоты. В течение 1—2 суток размачивают мелкие семена, плоды, листья, траву, цветки. Кору, корни, корневища, твердые семена рекомендуется размачивать около 3 суток, иногда до 4—5 суток. После этого сырье перекладывают в 96%-ный спирт с небольшим' количеством глицерина (чтобы спирт меньше улетучивался). Затем делают срезы — поперечные и продольные (радиальные или тангентальные) бритвой, лезвием или на микротоме. Мелкие объекты резать трудно, их помещают в парафин, пробку .

Приготовление срезов.Приготовление срезов в парафине. Из куска парафина скальпелем вырезают прямоугольник (блок), который удобно держать в руке, размером 1x2 см. В верхнюю часть парафина вставляют нагретый в пламени горелки кончик препаровальной иглы; в расплавленную ямочку быстро опускают размягченное семя или плод. Через несколько минут парафин застывает. Выравнивают поверхность парафина и отрезают верхушку объекта. Затем делают срезы вместе с парафином, после чего парафин отбрасывают.

Приготовление крупных размягченных объектов. Кору, корневища, толстые корни, крупные плоды, семена при изготовлении среза держат в руке. Подравнивают скальпелем поверхность и делают срез бритвой или лезвием.

Техника микроскопического исследований лекарственного сырья

Препараты цельного сырья (листья, травы, цветки). Препараты для микроскопического анализа готовят из сырья, предварительно просветленного в растворе КОН. Для этого кусочки листовой пластинки (с краем листа, жилкой), венчика и чашечки, иногда стеблей (в безлистном сырье) кипятят в 5%-ном водном растворе КОН 1—2 мин в зависимости от толщины листа, затем содержимое пробирки выливают в чашку, жидкость сливают, сырье промывают и оставляют в воде. Кусочки сырья берут лопаточкой или препаровальной иглой, если листья тонкие и собираются при вынимании в складочки, подводят предметное стекло в воду под кусочек листа, вынимают его иглой на стекло и расправляют. Если лист надо рассматривать с двух сторон, кусочек листовой пластинки разрывают на две части скальпелем на предметном стекле, одну часть осторожно перевертывают и помещают рядом со второй. Плотные листья при рассмотрении раздавливают лопаточкой или скальпелем, иногда готовят срезы в пробке. Готовые препараты и срезы просматривают в растворе хлоралгидрата. Если требуется приготовить срез листа, выбирают кусочек, содержащий главную жилку; мелкие листья рассматривают целиком.

Препарат готовят так, чтобы срез прошел поперек главной жилки и в него попала часть мезофилла с более мелкими жилками. Обращают внимание на число, форму и расположение ксилемы и флоэмы в проводящих пучках жилки, присутствие кристаллоносной обкладки, строение мезофилла (расположение палисадной ткани с одной или с двух сторон, наличие губчатой ткани; например в изолатеральном листе палисадная ткань имеется с обеих сторон) и на включения.

Препараты резаного сырья. Листья, травы, цветки исследуют так же, как цельное сырье.

Плоды и семена. При анализе плодов и семян обычно делают поперечные, иногда продольные срезы; кожуру рассматривают с поверхности. Поперечные срезы готовят из предварительно обработанного сырья, (увлажненного в камере или размягченного в водяных парах). Мелкие объекты режут в пробке, сердцевине бузины или в парафине.

Резаная кора. Препараты готовят путем кипячения кусочков 6 5%-ном растворе NaOH в течение 3—5 мин, промывают в воде, раздавливают объект и смотрят препарат в растворе хлоралгидрата. Микрохимические реакции проводят с соскобом коры или с ее 10%-ным отваром после охлаждения: на одревесневшие элементы, крахмал (иногда) и на действующие вещества (дубильные, антраценопроизводные и некоторые другие).

Подземные органы (корни, корневища, клубни, луковицы). Подготовленное сырье (размоченное и размягченное) исследуют на поперечных и продольных срезах. Толстые срезы рассматривают в лупу (ув.х 10), обращая внимание на общее строение. На тонких срезах выявляют диагностические признаки.

Резаное сырье исследуют после кипячения кусочков в 5%-ном растворе NaOH, промывают в воде и раздавливают на предметном стекле. Объекты рассматривают в растворе хлоралгидрата.

Препараты растительных порошков. Для приготовления препаратов всех морфологических групп на предметное стекло помещают 1—2 капли включающей жидкости, смачивают в ней конец препаровальной иглы или скальпеля и берут исследуемый порошок; переносят его на предметное стекло в жидкость; осторожно, чтобы не попал воздух, накрывают покровным стеклом. Если при этом жидкости под стеклом оказалось мало, добавляют ее из пипетки рядом с покровным стеклом (она быстро затягивается под стекло). Если жидкости окажется много, её удаляют, не снимая стекла полоской фильтровальной бумаги. Необходимо соблюдать правило: на предметное стекло вначале следует вносить включающую жидкость, а затем порошок, чтобы не загрязнить реактивы.

Препараты готовят в растворе хлоралгидрата или в, растворе КОН, медленно нагревают до полного просветления и выявляют все диагностические признаки. При необходимости проводят микрохимические реакции.

Диагностические признаки лекарственного сырья под микроскопом

Морфологические группы лекарственного растительного сырья (листья, кора, корни и др.) различают под микроскопом по диагностическим признакам. Основные диагностические признаки листьев — эпидерма, волоски, железки, тип устьиц, форма кристаллических включений, форма вместилищ и др.

Эпидерма. Клетки эпидермы бывают с прямыми или извилистыми боковыми стенками, иногда с четковидными утолщениями (рис. 12).

Имеет значение и характер кутикулы (пленка, покрывающая эпидерму, состоящая из кутина). Например, эпидерма листьев толокнянки, эвкалипта имеет толстый ровный слой кутикулы, эпидерма листа белладонны, горицвета — складчатую кутикулу. На эпидерме листа есть устьица; их форма, расположение (с одной или с двух сторон листа), характер окружения их клетками эпидермы постоянны и характерны для видов некоторых семейств. Например, у большинства растений семейства яснотковых устьица окружены двумя клетками эпидермы, которые расположены так, что их смежные стенки перпендикулярны к устьичной щели. У некоторых растений , есть водяные устьица, находящиеся на верхушке и зубчиках листа. В эпидерме листьев крапивы имеются клетки, содержащие цистолиты. Рис. 13. Различные типы волосков и железок: /— простые волоски многоклеточные, 2— волоски с бородавчатой поверхностью, 3— головчатые волоски, 4— бичевидные волоски, 5— звездчатые волоски, 6—Т-образные волоски, 7— ретортовидный волосок, 8— жгучий волосок, 9— конусовидный волосок, 10— гусеницеобразный (волосок, 11—ветвистый волосок, 12—пучковый волосок, 13—железка растений семейства сложноцветных (а—вид сверху, б — вид сбоку), 14— железка растений семейства губоцветных (а— вид с поверхности, б — вид сбоку)

Волоски. Их форма очень разнообразна (рис. 13). Встречаются волоски простые и головчатые. Простые волоски бывают одно- или многоклеточными, ветвистыми, извилистыми, звездчатыми, многолучевыми, пучковыми, Т-образными, жгучими (у крапивы). Поверхность волоска может быть гладкой или бородавчатой, что зависит от характера кутикулы, покрывающей волосок. Головчатые, волоски отличаются размером, строением ножки и головки. У некоторых растений в головке волоска, под кутикулой, скапливается эфирное масло. Головка может быть шаровидной, овальной, одно-, двух-, многоклеточной, ножка — одноклеточной и многоклеточной.

Железки и эндогенные вместилища эфирных масел, смолистых веществ, млечники, секреторные ходы. Строение железок, вместилищ с эфирным маслом характерно для каждого вида растений, а иногда и для семейства (железки у растений яснотковых, астровых). Вместилища бывают схизогенные (образующиеся путем расхождения клеток) и схизолизигенные (вначале клетки расходятся, а затем растворяются). Млечники и секреторные каналы отличаются составом содержимого и обычно сопровождают проводящие пучки, жилки.

Кристаллы. В растениях часто встречаются кристаллы оксалата кальция. Форма кристаллов, разнообразна (рис. 4 и «Анализа фитосборов»): друзы, рафиды, «кристаллический песок», одиночные кристаллы; иногда они образуют сростки и кристаллоносную обкладку. В листьях некоторых растений имеются клетки, содержащие карбонат кальция (например, цистолиты в листьях крапивы двудомной). Все кристаллические образования находятся в мезофилле листа. Особые образования—сферокристаллы (гликозиды) — расположены в эпидерме. Кремнезем откладывается в клеточной оболочке.

Цветки. В качестве лекарственного сырья цветки используют в цельном виде. При их анализе могут играть роль эфирномасличные железки, кристаллы, сосочковидные выросты на эпидерме, волоски и пыльца характерной формы и размеров, иногда механические элементы.

Травы. Основное внимание обращают на признаки листьев, так как травы определяют по листьям. Иногда имеют значение элементы стеблей, цветков, плодов. На стеблях наиболее характерны эпидерма с многоугольными вытянутыми клетками, обрывки крупных прямых сосудов (в отличие от разветвляющихся жилок листа), механические волокна.

Плоды. У плодов рассматривают строение околоплодника, в котором, различают три, слоя: наружный — экзокарпий (внеплодник), средний— мезокарпий (внутриплодник) и внутренний— эндокарпий. Диагностические признаки сочных и сухих плодов резко отличаются. В порошках диагностическое значение имеют механические элементы кожуры семени и околоплодника,  иногда: волоски, канальцы. Клетки питательной ткани заполнены жирным маслом и алейроновыми зернами, реже крахмальными зернами; их присутствие легко обнаружить микрохимическими реакциями.

Семена. На поперечных срезах обращают внимание на общее строение семени, кожуры, запасной питательной ткани — эндосперма и зародыша. В кожуре важное значение имеет механический слой, состоящий из радиально вытянутых или изодиаметрических клеток. Эндосперм и зародыш состоят из однородных клеток; значение имеет также содержимое клеток — жирное масло, крахмал, алейроновые зерна. При измельчении семян лучше сохраняются волоски и слои кожуры, особенно механический и пигментный.

Корни, корневища, клубни. На поперечном срезе обращают внимание на тип их строения у двудольных растений: пучковый или непучковый (пучки открытые или закрытые, коллатеральные или биколлатеральные). При непучковом типе отмечают характер древесины, расположение в ней сосудов, ширину сердцевинных лучей, характер вторичного утолщения сосудов и трахеид (спиральные, лестничные, сетчатые пористые, с простыми или окаймленными порами); на механические элементы — волокна, каменистые клетки и др. (рис. 15).

Рис. 15. Сосуды и механические элементы. А — сосуды /— кольчатый и спиральный, 2— сетчатый, 3— лестничный, 4—точечные; Б — каменистые клетки; В — волокна; Г — волокна в поперечном сечении

У одних растений имеются млечники (одуванчик, кендырь), у других—секреторные вместилища с эфирным маслом или смолой (девясил, женьшень, левзея).

Имеет значение вид запасных питательных веществ (крахмал, инулин, жирное масло) и форма кристаллов оксалата кальция. При анализе подземных органов используют микрохимические реакции (на запасные питательные вещества, одревесневшие элементы и др.).

Кора. Диагностические признаки этого сырья — расположение и характер механических элементов: лубяных волокон и каменистых клеток, колленхимы. Механические элементы располагаются одиночно или группами, рассеянно или поясами, иногда лубяные волокна окружены кристаллоносной обкладкой. Обращают внимание на строение пробки. В коре некоторых растений имеются млечники или вместилища с эфирным маслом, включения оксалата кальция. Некоторые виды коры подвергают микросублимации. Проводят качественные химические реакции.

Дораспечатать схему№4-стр.45 из «Анализа фитосборов» и стр.48-52.А также  стр.54-56 «Анализа фитосборов»