Цитокины: общие сведения

Цитокины: общие сведения.

Термин предложен С. Кохеном в 1974г.

Цитокины – группа гормоноподобных белков и пептидов, с молекулярной массой от 8 до 90 кДа, часто гликозилированных, синтезируемых и секретируемых клетками иммунной системы и другими типами клеток. От гормонов цитокины отличаются лишь частично: они продуцируются не железами внутренней секреции, а различными типами клеток; кроме того, они контролируют гораздо более широкий спектр клеток-мишеней по сравнению с гормонами. Разнообразные биологические функции цитокинов подразделяются на группы:

• они управляют развитием и гомеостазом иммунной систем;
• осуществляют контроль за ростом и дифференцировкой клеток крови (системой гемопоэза);
• принимают участие в неспецифических защитных реакциях организма, оказывая влияние на воспалительные процессы, свертывание крови, кровяное давление;
• цитокины принимают участие в регуляции роста, дифференцировки и продолжительности жизни клеток, а также в управлении апоптозом.

По структуре выделяют несколько разновидностей молекул цитокинов, каждый из которых кодируется собственными генами. Состоят цитокины из одной – двух, реже более, полипептидных (гомо- и гетерологичных) цепей (мономеры, димеры, тримеры)‚ с молекулярной массой от 8 до 90 кДа, в основном 15-35 кДа. Подавляющее большинство из них в качестве характерного структурного элемента содержит 4 α-спирали и лишь для немногих (ИЛ-1, ФНОβ, трансформирующий фактор роста) характерно преобладание β-слоистой структуры.  

Клетки-продуценты цитокинов.

Можно выделить 3 относительно автономные группы клеток – продуцентов цитокинов. Это:

• стромальные соединительнотканные клетки, которые вырабатывают цитокины и ответственны преимущественно за гемопоэз;  
• моноциты/макрофаги, которые являются продуцентами цитокинов – медиаторов воспаления;  
• лимфоциты, вырабатывающие лимфокины, которые обеспечивают развитие антигенспецифической составляющей иммунного ответа.

Все клетки-продуценты цитокинов характеризуются своим собственным типом ответа на активирующие воздействия и природой активаторов, а также собственным, хотя и значительно перекрывающимся набором продуцируемых ими цитокинов и теми процессами, реализацию которых они обеспечивают.

В норме уровень продукции цитокинов стромальными клетками невысок. Стимулами для выработки этих цитокинов в отсутствие повреждающих и патогенных факторов служат, по-видимому, контакты с кроветворными клетками. Бактериальные продукты существенно усиливают выработку указанных цитокинов, причем это происходит не только в кроветворных органах, но и в очагах агрессии, что приводит к формированию экстрамедуллярных очагов кроветворения. В условиях активации аналогичную активность проявляют эпителиальные клетки кожи и слизистых оболочек.

Выработка цитокинов (монокинов) клетками миелоидно-моноцитарного происхождения индуцируется главным образом под воздействием бактериальных продуктов. Вызвать ее могут также многие метаболиты, сами цитокины, пептидные факторы, полиэлектролиты, а также контакты с окружающими клетками, процессы адгезии и фагоцитоза. Активация цитокиновых генов происходит в моноцитах и макрофагах в пределах 1ч, и в ближайшие часы цитокин уже можно обнаружить в среде. Среди выделяемых этими клетками цитокинов преобладают факторы, участвующие в развитии воспаления. Их называют монокинами.

Третью группу клеток – продуцентов цитокинов (лимфокинов) составляют лимфоциты. Практически все разновидности лимфоцитов способны выделять цитокины, однако «профессиональными» продуцентами их являются СD4+-клетки-хелперы. Покоящиеся лимфоциты не продуцируют гуморальных факторов. Активация клеток осуществляется в результате связывания антигенраспознающих рецепторов и корецепторов. Самый ранний из лимфокинов – ИЛ-2 – появляется в цитоплазме Т-клеток через 2 часа после стимуляции; остальные лимфокины вырабатываются значительно позже и в определенной последовательности: ИЛ-4 через 4 часа, ИЛ-10 через 6 часа, ИЛ-9 через 24 часа. Пик выработки различных лимфокинов варьирует: 12 ч для ИЛ-2, 48 ч для ИЛ-4 и 5, 72 ч для ИЛ-9 и ИФНγ. Эта последовательность отражает процессы дифференцировки Т-хелперов.

После выделения клетками-продуцентами цитокины имеют короткий период полувыведения из кровотока. До 50% циркулирующих цитокинов интернализуется в течение 30 минут. Выведение катаболизированных цитокинов из организма осуществляется печенью и почками. Секреция цитокинов – краткосрочный процесс. Кодирующая цитокины мРНК нестабильна, что в сочетании с краткосрочностью транскрипции генов цитокинов приводит к краткосрочности их биосинтеза. [2].

Говоря об особенностях цитокинов, нужно учитывать следующее:

• Один цитокин может продуцироваться более чем одним типом клеток;
• Одна клетка может продуцировать более чем один цитокин;
• Один цитокин может действовать на более чем один тип клеток;

Более чем один цитокин может индуцировать одинаковую функцию у конкретно взятого типа клеток. [1].

Обладая широким спектром биологической активности, они определяют не только адекватный уровень иммунного ответа, но и регулируют взаимодействия главных биологических интегративных систем организма – нервной, иммунной и эндокринной.

Цитокины взаимосвязаны и образуют цельную систему взаимодействующих элементов – цитокиновую сеть.

Рецепторы цитокинов и механизм действия цитокинов на клетку.

Цитокины действуют: 

• аутокринно (т.е. на клетку, которая их продуцирует);  
• паракринно (на клетки, расположенные вблизи, например в очаге воспаления или в лимфоидном органе);  
• эндокринно-дистанционно – на клетки любых органов и тканей после попадания цитокина в циркуляцию крови [3].

Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул происходит кратковременно и жестко регулируется.

Одна часть цитокинов обладает плюрипотентным действием, т.е. действует на различные клетки-мишени, другая – оказывает специфическое воздействие на определенные клеточные линии. Влияние цитокинов на пролиферацию и дифференцировку клеток-мишеней подчиняется определенной последовательности; немаловажным также является концентрация и комбинация действующих цитокинов.

Цитокины – гидрофильные сигнальные вещества, действие которых опосредовано специфическими высокоаффинными рецепторами на внешней стороне плазматической мембраны, чувствительных к цитокинам клеток.

Все рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные гликопротеины, у которых внеклеточная часть отвечает за связывание цитокина. Как правило, эти рецепторы состоят более чем из одной субъединицы, причем высокоаффинное связывание является следствием взаимодействия с разными субъединицами, каждая из которых сама способна связывать соответствующий цитокин, но с более низкой аффинностью. Нередко на клетках-мишенях цитокинов обнаруживаются несколько типов центров связывания, различающихся аффинностью к цитокину. В составе клеточных мембран одни цепи реагируют только с определенным цитокином, в то время как другие способны формировать общие рецепторы для разных цитокинов. Наличие общих структур в рецепторах может обусловливать функциональное сходство ряда цитокинов. [2]

Определение биологической активности цитокинов.

В комплексный анализ системы цитокинов входит следующее:

I. Оценка клеток-продуцентов.

1. Определение  экспрессии:

•  рецепторов, распознающих патоген или антиген TКР, TLR) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии);

•  адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР и др.);

• генов цитокинов (ПЦР); белковых молекул цитокинов (оценка цитокинсинтезирующей функции мононуклеарных клеток человека).

2. Количественное  определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2 Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины.

II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.

1. Tестирование биологической активности цитокинов.
2. Количественное определение цитокинов с помощью ИФА.
3. Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях.
4. Определение соотношения оппозитных цитокинов (про- и противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.

III. Оценка клеток-мишеней.

1. Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии).
2. Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом.
3. Определение функциональной активности клеток-мишеней.

В настоящее время разработаны многочисленные методы оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию. Среди них различают:

1. молекулярно-биологические методы;
2. методы количественного определения цитокинов с помощью иммуноанализа;
3. тестирование биологической активности цитокинов;
4. внутриклеточное окрашивание цитокинов;
5. метод ELISPOT, позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки;
6. иммунофлюоресценцию. [4]

Краткая характеристика этих методов.

С помощью молекулярно-биологических методов можно исследовать экспрессию генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, изучать полиморфизм указанных генов. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов молекул системы цитокинов и предрасположенностью

к ряду заболеваний. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать информацию о генетически запрограммированной продукции того или иного цитокина. Наиболее чувствительной считается полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР-РВ. Метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессиии цитокиновых генов.

Количественное определение цитокинов в биологических жидкостях и в культурах мононуклеарных клеток периферической крови методом ИФА можно охарактеризовать следующим образом. Поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях, например в слезе, смывах из полостей, моче, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости и т.д. Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние иммунной системы, т.е. синтез цитокинов клетками организма in vivo.

Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНК) показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МНК в культуре свидетельствует, что клетки уже активированы in vivo.Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Цитокины не специфичны в отношении конкретного антигена. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невозможна. В то же время оценка уровней цитокинов позволяет получить данные о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, функциональной активности клеток иммунной системы, о соотношении Th1- и Th2-клеток, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.

В биологических средах можно определить цитокины количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа,используя поликлональные и моноклональные антитела. ИФА позволяет узнать, каковы точные концентрации цитокинов в биологических жидкостях организма. Иммуноферментное выявление цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими методами (высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета, стандартизации учета). Однако и этот метод имеет свои ограничения: ИФА не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.

Биологическое тестирование проводят на основе знания основных свойств цитокинов, их действия на клетки-мишени. Изучение биологических эффектов цитокинов позволило разработать четыре разновидности тестирования цитокинов:

1. по индукции пролиферации клеток-мишеней;
2. по цитотоксическому эффекту;
3. по индукции дифференцировки костно-мозговых предшественников;
4. по противовирусному действию.

ИЛ-1 определяют по стимулирующему действию на пролиферацию мышиных тимоцитов, активированных митогеном in vitro; ИЛ-2 - по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов; по цитотоксическому действию на мышиные фибробласты (L929) тестируют ФНОа и лимфотоксины. Колониестимулирующие факторы оценивают по их способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в агаре. Противовирусную активность ИФН выявляют по угнетению цитопатического действия вирусов в культуре диплоидных фибробластов человека и опухолевой линии фибробластов мышей L-929.