Способ получения янтарной кислоты с использованием дрожжей, принадлежащих к роду yarrowia

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ  ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Yarrowia

Изобретение относится к биотехнологии и  генной инженерии и касается способа  получения янтарной кислоты с  использованием штамма дрожжей, Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3314. Данные дрожжи модифицированы таким образом, что у них снижена активность сукцинатдегидрогеназы. Способ включает стадию выращивания штамма дрожжей в питательной среде, содержащей глицерин, и выделения янтарной кислоты из культуральной жидкости. Использование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3314 привело к существенному увеличению продукции янтарной кислоты этим способом.

Yarrowia lipolytica являются уникальными дрожжами в виду их способности к продукции широкого спектра органических кислот, включая интермедиаты цикла трикарбоновых кислот, такие как лимонная и изолимонная кислоты, и секреции их в среду. Установлено, что в ходе продолжительного выращивания Y.lipolytica N 1 потребность в кислороде для роста, а также синтез лимонной кислоты зависят от концентрации железа в питательной среде. Установлен связанный эффект влияния концентраций кислорода и железа на функционирование митохондриального транспорта электронов транспортной цепи в штамме Y lipolytica N 1. На основе результатов, полученных в ходе продолжительного выращивания, предложены условия для производства лимонной кислоты в дозированной среде с помощью Y.lipolytica N 1.

Янтарная  кислота, член семейства С4-дикарбоновых кислот, широко используется в производстве пищи, медикаментов и биодеградируемых пластмасс. Традиционно янтарную кислоту производят путем химического синтеза из нефтяного сырья, которое является невозобновимым, кроме того, процесс химического синтеза приводит к загрязнению окружающей среды. Поэтому большое внимание уделяется использованию эффективных природных продуцентов янтарной кислоты, таких как микроорганизмы.

Большинство описанных попыток увеличить  продукцию промышленно значимой янтарной кислоты (сукцината) проводили в анаэробных условиях, в которых ферментация Escherichia coli приводит к получению смеси кислот. Разработаны стратегии использования системы аэробной продукции сукцината, позволяющие штаммам Е.coli эффективно производить и накапливать сукцинат, и такая система является базисом для увеличения аэробной продукции сукцината в Е.coli, основанной на создании нового аэробного центрального метаболизма (Lin Н. et al., Biotechnol Bioeng; 89(2): 148-56(2005)).

Использование питательных сред с определенным химическим составом позволяет проводить  различные исследования метаболизма, которые невозможны со средами с  неопределенным составом. Среда с  определенным составом АМ3 была создана  для расширения экспериментальных  возможностей при изучении метаболизма  при ферментации Actinobacillus succinogenes, продуцирующих сукцинат. Было произведено сравнение тенденций роста A.succinogenes и набор конечных продуктов при ферментации в среде АМ3 и в богатой среде. Неспособность к синтезу -кетоглутарата из глюкозы указывает на то, что активности по крайней мере двух ферментов цикла трикарбоновых кислот отсутствуют в A.succinogenes (McKinlay J.B. et al., Appl Environ Microbiol; 71(11):6651-6(2005)).

Описан способ получения янтарной кислоты из промышленных гидролизатов, включающий стадии: выращивание микроорганизмов (Е.coli, Klebsiela, Erwinia, Lactobacillus), содержащих мутации в генах ptsG, pflB, and ldhA с целью накопления биомассы; и предоставление микроорганизмам возможности метаболизировать гидролизаты (US 20030017559 A1).

Сукцинатдегидрогеназа (SDH) из Saccharomyces cerevisiae состоит из четырех субъединиц, кодирующихся генами SDH1, SDH2, SDH3 и SDH4. Было установлено, что разрушение двух генов SDH1 и SDH2 или SDH1b (гомолог SDH1) необходимо для полной утраты активности SDH и что ген SDH1b компенсирует функцию гена SDH1. Мутанты с разрушенными генами SDH1 и SDH1B показали небольшое увеличение продукции сукцината (до 1.9 раза) наряду с уменьшением продукции малата в сравнении с исходными штаммами в условиях культивирования со встряхиванием (Kubo Y. et al., J Biosci Bioeng; 90(6):619-24(2000)).

Путь, приводящий к накоплению сукцината, был изучен в жидкой культуре в присутствии высокой концентрации глюкозы (15%) в аэробных и анаэробных условиях с использованием серии штаммов Saccharomyces cerevisiae, в которых были разрушены различные гены, кодирующие ферменты, требующиеся в цикле трикарбоновых кислот. Полученные результаты свидетельствуют о том, что сукцинат может быть синтезирован двумя путями, а именно окислением  -кетоглутарата через цикл трикарбоновых кислот и восстановлением фумарата в анаэробных условиях (Arikawa Y. et al., J Biosci Bioeng; 87(1):28-36(1999)).

СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО  БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Использование: биотехнология, биосинтез лимонной кислоты. Сущность изобретения: способ заключается в выращивании на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в  условиях аэрации и перемешивания  консорциума штаммов грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного сахара 10-40% от исходного неинвертированного сахара, вносят биокатализатор N-трис-/гидроксиэтил/ аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10-5-10-7 г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов. 2 табл.

 Изобретение  относится к биотехнологии, а  именно, к способам получения  лимонной кислоты.

 Лимонная  кислота используется в фармацевтической, пищевой и кондитерской промышленностях,  ее потребность возрастает.

 Лимонную кислоту синтезируют микроорганизмы различных родов и видов, в основном, в промышленности культивируют грибы Aspergillus niger, потребляющие углеводсодержащие субстраты (Biotechnol. Lett, 1985, 7, N11) и дрожжи Candida lipolytica (заявка ФРГ 2002028, заявка Японии 55-1039), утилизирующие непищевые источники углерода, такие как углеводороды, спирты.

 При этом  основным недостатком способов  выращивания грибов Aspergillus niger является то, что процесс синтеза лимонной кислоты длителен 5-7 суток. Использование же дрожжевых культур p. Candida ограничено сырьевой базой, так большинство штаммов дрожжей p. Candida не способны инвертировать сахар, потреблять пивную дробину, необработанное зерно и др. к тому же при потреблении углеводородов и этилового спирта дрожжи синтезируют смесь лимонной и изолимонных кислот, что вызывает дополнительные сложности при выделении лимонной кислоты, в связи с чем повышается ее себестоимость.

 Наиболее близким является способ получения лимонной кислоты при глубинном выращивании грибов Aspergillus niger на сахаре (Смирнов В.А. Пищевые кислоты. М. Лесная и пищевая промышленность, 1983 г. стр.94-97( грибы Aspergillus niger предлагается выращивать на питательной среде, содержащей источники Fe, Mg, Mn, Zn, Cu, K, в лимите по азоту, фосфору при избытке углеродсодержащего субстрата, при перемешивании, аэрации. Выращивание проводили в течение 7-9 суток, при этом выход лимонной кислоты от поданного субстрата составлял 100%

 Недостатком  выше описанного способа является  то, что процесс длительный, себестоимость  продукции высокая из-за больших энергозатрат на стадии выращивания.

 Предлагаемое  изобретение решает следующую  научно-техническую задачу: снизить  себестоимость лимонной кислоты.

 Технический  результат предлагаемого способа  заключается в сокращении времени  биосинтеза.

Данный технический  результат достигается тем, что  биосинтез лимонной кислоты осуществляется на питательной среде, содержащей сахар, источники минерального питания, в  условиях аэрации и перемешивания, в качестве продуцентов используют консорциум штаммов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica, причем дрожжи засевают по достижении концентрации грибов 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного содержания сахара, вносят биокатализатор N-трис-(гидроксиэтил)аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10-5-10-7г/л, при этом засевная концентрация дрожжей составляет 10-80% от текущей концентрации грибов.

 Перечисленные  признаки в совокупности обеспечивают  более полное потребление субстратов, уменьшение сроков выращивания  до 4-х суток за счет более  высокой скорости синтеза лимонной  кислоты консорциумом микроорганизмов  при внесении биокатализатора.

 Сущность способа направленного биосинтеза лимонной кислоты заключается в том, что на питательную среду, содержащую хлористый аммоний 1 г/л, однозамещенный фосфат калия 0,3 г/л, сернокислый цинк, водный 0,02 г/л, сахар 5% засевали консорциум грибов Aspergillus niger выращивали при перемешивании и аэрации в аппарате V 3 л до концентрации сухих грибных клеток 5-10 г/л, остаточного неинвертированного сахара 10-40% от исходного сахара в среде при Т-32С, pH 5,5, pH поддерживали внесением 10-ного NaOH, далее вносили биокатализатор N-трис-гидроксиэтил-аммониевую соль метилфенил сульфонилуксусной кислоты в количестве 10-5-10-7 г/л, засевали культуру дрожжей Candida lipolytica в количестве 10-80% от текущей концентрации грибов и вели выращивание до окончания процесса синтеза лимонной кислоты. В культуральной жидкости определяли в процессе выращивания содержание лимонной кислоты спектрофотометрическим методом, концентрацию биомассы - весовым методом.

 Выбранный  диапазон концентраций биокатализатора  определялся тем, что при концентрации  меньше 10 г/л активация дыхания  в клетках не происходила, а  внесение более высоких концентраций  более 10 г/л оказывало воздействие  значительно, но при этом резко  повышалась себестоимость процесса.

 Использование  консорциума штаммов обусловлено  комменсализмом грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica: дрожжи Candida lipolytica не способны синтезировать ферменты, инвертирующие сахар, гидролизующие зерно, муку, также штаммы дрожжей p.Candida являются биотин и тиаминзависимыми, в то время как штаммы Aspergillus niger способны синтезировать перечисленные выше ферменты и обладают способностью синтезировать тиамин. При этом дрожжи Candida lipolytica, так и грибы Aspergillus niger способны синтезировать лимонную кислоту, а скорость синтеза лимонной кислоты у дрожжей Candida lipolytica выше, чем у грибов и это присуще всем штаммам грибов Aspergillus niger и дрожжей Candida lipolytica.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ  СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ И НУКЛЕИНОВЫХ  КОМПОНЕНТОВ из автолизатов дрожжей с выделением целевого продукта на ионообменной смоле с элюцией разбавленным раствором аммиака, отличающийся тем, что , с целью удешевления и упрощения процесса, в качестве автолизатов используют отходы производства белково-витаминного концентрата на основе штамма Candida utilis ВСБ-651-жидкую фракцию, полученную после отделения биомассы дрожжей, а в качестве ионнообменной смолы используют катионит Амберлит IR-120 в водородной форме.

Использование этого способа позволяет:

-получить ценный продукт - смесь природных аминокислот;

-улучшить экологию окружающей среды;

-использовать аминокислоты в составе питательных сред для выращивания     культуры ткани клеток и приготовления питательных сред для выращивания штаммов, микроорганизмов;

-использовать этот продукт для подкорма пчел;

-использовать данный продукт в косметологии для приготовления кремов, шампуней, бальзамов.