Принципи фотометрії

                      lg(I₀/I) = k*1*C

де k*1 - коефіцієнт пропорційності; С - концентрація розчиненої речовини. Залежність інтенсивності монохроматичного світлового потоку, що пройшов через шар забарвленого розчину, від інтенсивності падаючого потоку світла, концентрації забарвленої речовини і товщини шару розчину визначається об'єднаним законом Бугера-Ламберта-Бера, що є основним законом світлопоглинання і лежить в основі більшості фотометричних методів аналізу:

                    I = I₀*10-kCl

де k - коефіцієнт светопоглощения, що залежить від природи розчиненої речовини, температури, розчинника і  довжини хвилі світла.

   При дотриманні основного закону светопоглощения оптична щільність розчину прямо пропорційна молярному коефіцієнту светопоглощения, концентрації поглинаючого речовини і товщині шаруючи розчину:

                  А = kCl

   При графічному зображенні залежності оптичної щільності від концентрації (при постійному значенні l) виходить пряма лінія. Ця пряма проходить через початок координат при відсутності поглинання світла розчинником і систематичними погрішностями.

Рівняння 4 і 5 виведені для монохроматичного світла, тобто світла визначеної довжини хвилі, що може бути виділений за допомогою спеціального оптичного пристрою - монохроматора. У фотоколориметрі вимір інтенсивності світлових потоків роблять не в монохроматичному, а в поліхроматичному світлі, тобто на досить широкій ділянці спектра - в інтервалі довжин хвиль 20-100 нм.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Розділ V

   Спектр поглинання, чи, більш коректно, абсолютний спектр поглинання речовини являє собою залежність кількості поглиненого світла від довжини хвилі.Такі спектри для барвників у видимій області (400-700 нм) мають іноді кілька максимумів. Спектри поглинання в ультрафіолетовій (200-400 нм) і видимих областях відбивають переходи зв'язаних і незв'язаних електронів у молекулі.

   Це звичайно делокалізовані-електрони подвійних С=С зв'язків і неподілені пари азоту і кисню. Оскільки, як правило, всі електрони в молекулі при кімнатній температурі знаходяться на нижньому енергетичному рівні, спектри в цій області подають інформацію про основному і першому збудженому електронні стани молекули.

   Через те, що довжина хвилі поглиненого світла відповідає визначеному переходу, піки на спектрах поглинання речовини обумовлені присутністю в ньому відомих структур. Положення максимуму спектра поглинання є важливою оптичною характеристикою речовини, а характер і вид спектра поглинання характеризують його якісну індивідуальність.

   Група в молекулі, що дає внесок у спектр її поглинання, називається хромофором. Такою групою є, наприклад, карбонільна група >С=О, що існує у всіх амінокислот. Іншим хромофором є пептидна група поліпептидних ланцюгів. До основних хромофорів білка відносяться залишки ароматичних кислот: триптофан і в меншому ступені тирозин і фенілаланін.

   Спектр поглинання триптофану, обумовлений його індольним кільцем із системою сполучених зв'язків, володіє двома смугами поглинання з максимумами при 220 і 280 нм. У нуклеїнових кислотах основними хромофорами є пуринові і пиримідинові азотисті основи нуклеотидів. При утворенні сполучених зв'язків у молекулі енергія збудженого стану електронів зменшується, і, отже, хромофор починає поглинати світло більшої довжини хвилі.

   Таке зрушення в спектрах поглинання називається батохромним. Навпаки, зрушення спектра в короткохвильову область іменується гіпсохромним. Гіперхромний і гіпохромний ефекти - це відповідно збільшення і зменшення екстинкції.

   Знайти дуже близько розташовані лінії коливальних і обертальних переходів на спектрах молекул удається лише при високій роздільній здатності (роздільною здатність називається здатність приладу розрізняти дві близько розташовані лінії).

 

 

Розділ VI

   Фотометричні методи визначення концентрації розчинів засновані на порівнянні поглинання при пропущенні світла стандартними і досліджуваними розчинами. Ступінь поглинання світла фотометруємим розчином вимірюють за допомогою фотоколориметрів і спектрофотометрів. Вимір оптичної щільності стандартного і досліджуваного забарвлених розчинів завжди роблять стосовно розчину порівняння (нульового (контрольного) розчину). Як розчин порівняння можна використовувати аліквотну частину досліджуваного розчину, що містить усі додані компоненти, крім реагенту, що утворить з обумовленою речовиною забарвлену сполуку. Якщо реагент, що додається, і всі інші компоненти розчину порівняння безбарвні і, отже, не поглинають променів у видимій області спектра, то як розчин порівняння можна використовувати дистильовану воду.

  Для визначення змісту речовини методом каліброваного графіка готують серію з 5-8 стандартних розчинів різних концентрацій.

  При виборі інтервалу концентрацій стандартних розчинів керуються наступними положеннями:

а) він повинний охоплювати область можливих змін концентрації досліджуваного розчину; бажано, щоб оптична щільність досліджуваного розчину відповідала приблизно середині градуювочної кривої;

б) бажано, щоб у цьому  інтервалі концентрацій при обраних товщині кювети і аналітичній довжині хвилі, дотримувався основний закон світлопоглинання, тобто графік А = f(C) був лінійним;

в) інтервал робочих значень, що відповідає інтервалу стандартних розчинів, повинний забезпечувати максимальну відтворюваність результатів вимірів.

   При сукупності перерахованих умов вимірюють оптичні щільності стандартних розчинів щодо розчинника і будують графік залежності А = f(C). Отримана крива називається каліброваною і має вид прямої що виходить з початку координат. Екстраполювати калібровану пряму до значень оптичних густин, що лежать вище останньої експериментально отриманої крапки, не рекомендується. Періодично (раз у тиждень чи рідше) калібровану криву перевіряють по 2-3 свіжовиготовленим стандартним розчинам. Калібровані графіки, побудовані з реактивами різних партій, як правило, не збігаються. Тому при зміні реактивів графік необхідно побудувати заново. Графік, побудований при роботі на одному приладі, не можна використовувати для розрахунків результатів, отриманих на іншому.

   Визначивши оптичну щільність досвідченого розчину Ах, знаходять її значення на осі ординат, а потім на осі абсцис - відповідне їй значення концентрації Сх.

  Цей метод застосовують при виконанні серійних фотометричних аналізів. Він дає гарні результати при дотриманні основного закону світлопоглинання.

   На відміну від інших фотометричних методів, метод градуювочного графіка дозволяє визначити концентрацію пофарбованих розчинів навіть у тих випадках, коли основний закон світлопоглинання не дотримується. Для побудови градуювочної кривої в цих випадках наготовлюють значно більше число стандартних розчинів, що відрізняються друг від друга по концентрації не більше ніж на 10%. Такий градуировочный графік, що має на положистій ділянці кут нахилу не менш 15°, усе-таки дозволяє проводити фотометричні виміри, незважаючи на те, що між концентрацією розчину і його оптичною щільністю немає лінійної залежності. Відтворюваність визначень у цьому випадку нижче, ніж у випадку лінійної залежності А = f(C).

   Для визначення концентрації речовини методом порівняння оптичних густин стандартного і досліджуваного розчинів беруть аликвотну частину досліджуваного розчину, наготовлюють з неї забарвлений розчин для фотометрування і вимірюють його оптичну щільність. Потім аналогічно наготовлюють 2-3 стандартних пофарбованих розчини обумовленої речовини відомої концентрації і вимірюють їхній оптичні щільності при тій же товщині шаруючи (у тих же кюветах).

  Метод порівняння застосовують при однократних визначеннях; він вимагає обов'язкового дотримання основного закону світлопоглинання.

   Існує й інший більш точний спосіб визначення невідомої концентрації Сх, називаний методом обмежуючих розчинів. Наготовлюють два стандартних розчини з концентраціями C₁ і С₂ так, щоб оптична щільність першого з них A₁ була б менше оптичної щільності А_х досліджуваного розчину, а оптична щільність А₂ другого стандартного розчину була б, навпаки, більше, ніж А_х.

Невідому концентрацію досліджуваної речовини розраховують по формулі:

C_х = C₁ + (C₂ – C₁)(A_х – A₁)/(A₂ – A₁)

 

 

 

 

 

 

 

 

Розділ VII

     Для фотометричних вимірів використовують дві великі групи приладів: фотоколориметри і спектрофотометри.

   У колориметрах потрібні спектральні діапазони виділяються за допомогою світлофільтрів, що обмежують ділянки спектра, у яких можуть проводиться виміри. У спектрофотометрах ділянки спектра виділяються за допомогою призм чи дифракційних ґрат, що дозволяє встановлювати будь-як довжину хвилі в заданому діапазоні.

   Конкретна послідовність операцій при вимірі оптичної щільності чи пропускання залежить від конструкції чи спектрофотометра колориметра.

Однак основні принципи залишаються  незмінними. Спочатку встановлюють необхідну  довжину хвилі, вибираючи світлофільтр на колориметрі чи обертаючи відповідну рукоятку на спектрофотометрі. Потім установлюють нуль. Для цього у світловий потік поміщають кювету зі стандартним розчином. Змінюючи ширину щілини, домагаються того, щоб показання приладу відповідали величині, передбаченою інструкцією. На наступному етапі стандартний розчин заміняють досліджуваним і роблять відлік величини оптичної щільності чи пропускання.

   Фотоелектроколориметр - це оптичний прилад, у якому монохроматизация потоку випромінювання здійснюється за допомогою світлофільтрів.

   Сучасні спектрофотометри дозволяють працювати з високомонохроматизированим потоком випромінювання. Вони застосовуються для концентраційного аналізу і при вивченні спектрів поглинання речовин.

   Структурну схему спектрофотометра можна представити у виді наступних основних блоків:

• джерело світла,
• монохроматор,
• кюветне відділення,
• фотоелемент,
• пристрій, що реєструє.

   Світловий пучок від джерела світла попадає в монохроматор через вхідну щілину і розкладається дифракційними ґратами чи призмою в спектр. У монохроматичний потік випромінювання, що надходить з вихідної щілини в кюветное відділення, по черзі вводяться контрольний і досліджуваний зразки. Випромінювання, що пройшло через кювету, попадає на фотоелемент, що перетворює світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.

   Монохроматор - це оптична система, що виділяє з усього спектра джерела світла випромінювання визначеної довжини хвилі. Це звичайно призми, що по-різному переломлюють світло різних довжин хвиль, чи дифракційні ґрати. У видимій області використовуються звичайні скляні призми, але в ультрафіолетовій області вони не годяться, оскільки скло починає поглинати вже при ? < 400 нм, тому призми роблять із кварцу.

Як монохроматори застосовуються також дифракційні ґрати, що являють  собою плоскопаралельну пластину з  нанесеними на ній рівнобіжними лініями - борозенками. Біле світло через дифракцію на рівнобіжних борозенках розкладається на безупинний спектр. Звичайно в монохроматорах спочатку виділяють пучок світла з визначеним діапазоном довжин хвиль за допомогою призми, а потім розкладають його ще раз ґратами. Так одержують строго монохроматичне світло.    Основне достоїнство дифракційних ґрат полягає в тому, що можна збільшувати їхню здатність, оскільки вона прямо пропорційна щільності ліній. Крім того, у всьому діапазоні довжин хвиль дифракційні ґрати мають лінійну роздільну здатність, тоді як роздільна здатність призменного монохроматора зі збільшенням довжини хвилі зменшується.

Досліджувану речовину розчиняють у відповідному розчині і поміщають в оптично прозору судину для вимірів - кювету. Звичайно кюветотримач має осередку для чотирьох кювет. Оскільки стекло поглинає ультрафіолетове світло, для проведення вимірів в ультрафіолетовій області спектра використовують кварцові кювети. Для вимірів у видимій області можна використовувати пластикові чи скляні кювети. При роботі з леткими чи хімічно активними речовинами кювети закривають кришками.

   Оскільки кювета, поміщена в спектрофотометр, стає складовою частиною його оптичної системи, з нею потрібно поводитись дуже акуратно. Подряпини і бруд на стінках кювети сильно розсіюють і поглинають світло, спотворюючи результати вимірів. Про цьому особливо треба пам'ятати при роботі в ультрафіолетовій області. Кювети можна протирати м'якими тканинами, наприклад, з бавовни. Не рекомендується використовувати для цих цілей фільтрувальний папір. Оскільки органічні молекули поглинають в ультрафіолетовій області, ні в якому разі не можна торкатися оптичних (прозорих) стінок кювети. Розчин краще заливати в кювету, поставивши її в попередньо вийнятий із приладу кюветотримач. Кювети досить тендітні, особливо кварцові, тому працювати з ними треба обережно, не допускаючи механічних ушкоджень.

   Уміст кювети повинний бути гомогенним - це необхідна умова одержання відтворених даних. Потрібно стежити за тим, щоб розчин не був мутним. Особливо заважають вимірам пухирці повітря, що сильно збільшують розсіювання. Не можна наливати в кювету дуже холодний розчин, оскільки при цьому на зовнішніх стінках кювети конденсуються пари води повітря, і стінки стають непрозорими.

   Якщо кювети забруднені сторонніми домішками, їх варто промити дистильованою водою і (чи) розчинником, у якому розчинена досліджувана речовина. Кювети можна мити м'якими детергентами. Не рекомендується мити кювети концентрованими кислотами чи лугами, а також іншими агентами, що отруйні.

   Кювети потрібно заповнювати до такого рівня, щоб потік випромінювання проходив цілком через шар розчину. Найчастіше використовуються кювети з оптичним шляхом 1 см, у які звичайно заливають 2,5-3 мл розчини. У такі кювети входить 4-5 мл, але заповнюють їхній цілком лише в тому випадку, коли це необхідно. Є кювети з оптичним шляхом 50, 20, 5, 2 і 1 мм.

Фотоелементи перетворюють світлову енергію в електричну. Електричний сигнал потім підсилюється і реєструється.

Фотони, бомбардуючи поверхню фотоелемента, вибивають з нього  електрони, кількість яких пропорційно  інтенсивності світла. Ці електрони летять до позитивного електрода. У результаті в замкнутому ланцюзі виникає електричний струм, що реєструється по спаданню напруги на опорі, що знаходиться в цьому ланцюзі. Напругу можна підсилити, і після компенсації такого сигналу потенціометром, відградуюванним в одиницях поглинання, на датчику реєструється безпосереднє поглинання зразка.