Планарная хроматография

Планарная хроматография

 

В методе ТСХ разделение смеси  происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. В основу метода заложены явления сорбции-десорбции. Использование различных сорбентов, позволяет значительно расширить и улучшить этот метод.  

Современная пластинка ТСХ представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера. Наибольшее распространение получили пластины на основе алюминиевой фольги или полимеров. Для закрепления сорбента применяют, гипс, крахмал, силиказоль и другие, которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (>100  мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

 

ТСХ применяют для разделения и анализа как органических, так и неорганических веществ. Этим методом можно разделить практически все неорганические  катионы и многие анионы,  близкие по свойствам ионы благородных металлов, лекарственные и наркотические средства, пестициды, аминокислоты, липиды, алкалоиды. С помощью ТСХ удобно анализировать малые количества веществ, оценивать чистоту препаратов, контролировать технологические процессы и состав сточных вод, предварительно подбирать условия для колоночной хроматографии.

Главной количественной характеристикой метода аналогично бумажной хроматографии является время удерживания Rf. (рис. )

R_f – коэффициент удерживания (время удерживания) - отношение расстояния, пройденного определяемым веществом h к расстоянию, пройденному подвижной фазой – элюентом H.

 

                                                                  R_f = h/H

 

Для пятен, имеющих правильную симметричную форму, величину h определяют по положению центра пятна, для несимметричных пятен – по положению максимума интенсивности. R_f является характеристикой природы определяемого соединения, зависит от сорбента и растворителя, используемых для разделения. Для надежности идентификации веществ, при определении R_f часто используют "свидетели". Для этого на пластинке вместе с разделяемой смесью веществ хроматографируют стандартные вещества, так называемые  "свидетели". В последнем случае определяют относительный коэффициент удерживания       R _отн по формуле:

                                                           R_отн = R_f(i) / R_f(_станд),

где R_f(i) – время удерживания i-того компонента; R_f(_станд) – время удерживания стандартного вещества.

 

                                               

Рис. Количественные характеристики хроматограммы

 

                                       http://www.referat.ru/cache/referats/26937/image004.gif

 

Сорбенты

 

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель. Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия с последующим высушиванием образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости обычно 5-20 мкм. 
Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы - ОН. Он легко сорбирует на своей поверхности воду и образует водородные связи.

 
Оксид алюминия является слабо основным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на оксиде алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием. Её проводят, выдерживая пластину в сушильном шкафу при температуре 100-150 ⁰С. Адсорбционная емкость оксида алюминия низкая, по сравнению с силикагелем.

 

Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.

 
Кремнекислый магний - менее полярный сорбент, чем силикагель.  Обычно его используют в случаях, когда адсорбенты с большей полярностью не дали эффективного разделения.

 
Целлюлоза очень эффективна для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой, в основном, шарики целлюлозы диаметром до 50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Однако, как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя на целлюлозе происходит очень медленно.

 

Указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств. К модификации относятся, например, пропитка сорбентов реактивами, создание пластин с обращенной фазой. Именно разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.

 

Растворители (элюенты)

В тонкослойной хроматографии в качестве подвижной фазы - элюента - используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа. Поэтому растворители, имеющие высокую температуру кипения, не применяют в ТСХ.  
Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Элюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого компонента выходило с R_f не более 0,5-0,6 и было хорошо отделено от примесей (~ 0,1 R_f ). Если на старте остались вещества   (R_f = 0), то следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси уже с другим элюентом. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте". Если под действием растворителей различной полярности: вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом растворителя, то следует перейти к другому сорбенту.  
Пример 1: R_f = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.  
Пример 2: R_f = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.

Подготовка пластин перед проведением анализа

Перед использованием пластины для ТСХ необходимо предварительно подготовить. Это связано с тем, что адсорбенты пластин при хранении поглощают из воздуха не только влагу, но и другие вещества. Если использовать неподготовленные пластины, то в процессе хроматографирования появляется фронт "загрязнений", который может мешать определению веществ, имеющие большие значения R_f.  Некоторые вещества, например, вода, могут изменять состав подвижной фазы, что ведет к получению других значений R_f. 
Предварительная подготовка пластин заключается в пропитке пластин чистым растворителем на всю высоту пластинки (метанол, бензол, диэтиловый эфир) и последующей сушке пластины в сушильном шкафу при температуре 110-120 °С в течении 0,5-1 часа. Таким способом можно подготовить сразу несколько пластин, которые при хранении  в сухом герметичном сосуде сохраняют свои свойства несколько месяцев.

Техника проведения анализа.

Нанесение исследуемого вещества на пластину влияет на получаемые результаты хроматографирования. Исследованию обычно подвергаются либо жидкие вещества, либо растворы твердых веществ без предварительной подготовки проб. На результаты разделения оказывает большое влияние концентрация наносимых веществ. В ТСХ принято использовать растворы с концентрацией вещества около 1%. Однако чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями. Если в исследуемом веществе общая концентрация компонентов неизвестна или известна концентрация, но такого типа вещества еще не хроматографировали, то нужно предварительно определить, какое количество исследуемого раствора достаточно для качественного анализа.

Для этого на пластину ТСХ нужно нанести несколько пятен хроматографируемого раствора. Пятна должны быть одного размера, но содержать разные количества анализируемого вещества, например, 1, 2, 5мкл. При правильно подобранной концентрации форма пятен разделенных веществ такая же, как и форма капли, нанесенной на линии старта. Если пятна имеют большие размеры, чем пятно на старте, то нанесенная концентрация слишком велика. Появление "хвостов", неправильная форма разделенных пятен на пластинке могут свидетельствовать как о высокой концентрации вещества, так и неправильно подобранной хроматографической системе, а также химическом взаимодействии разделяемых компонентов. Если вещества слишком мало, то пятно может не проявиться.

Типовая хроматограмма, полученная методом ТСХ, представлена на рис. .

 

 

Рис. Хроматограмма чернил в тонком слое                                                                                                              http://en.wikipedia.org/wiki/File:TLC_black_ink.jpg

        

Правильный подбор количества нанесенного вещества и системы растворителей дает возможность полного разделения на одной пластинке до десяти компонентов в исследуемых веществах. Удобно наносить образцы на специальном столике с трафаретами и подогревом. Каплю анализируемого вещества наносят на "линию старта", которую отмечают на расстоянии 1-2см от нижнего края пластинки, с помощью микрошприца или градуированного капилляра. Размер наносимого стартового пятна не должен превышать 2-3мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил. Кроме того границы разделенных компонентов могут перекрываться. Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 2см. 
При нанесении капли поверхность сорбента не должна разрушаться, так как это может повлиять на качество разделения. Капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием. На размер образующегося пятна влияет не только количества наносимого раствора, но и полярность растворителя и его температурные характеристики. Так при нанесении одного и того же вещества в различных растворителях, образовавшееся пятно, в котором в качестве растворителя использовали метанол будет больше, чем пятно от раствора его в хлороформе.

 

После нанесения исследуемых веществ  на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей. Даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на процесс разделения. Удаление растворителей обычно проводят сушкой пластин на воздухе в течение 5-10 мин, либо  в сушильном шкафу. Подогрев подложки делает испарение растворителей интенсивным, при этом размер пятна также уменьшается.

 
Затем пластинку помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой предварительно наливают небольшое количество растворителя (подвижная фаза). Если растворитель поступает на пластинку снизу вверх под действием капиллярных сил. То такая хроматография называется восходящей. По мере продвижения растворителя происходит разделение анализируемой смеси веществ в зависимости от их сродства к адсорбенту.

 

После окончания разделения пластинку с адсорбентом вынимают из камеры, отмечают фронт растворителя и обрабатывают специальными реагентами для обнаружения пятен, например, серной кислотой, йодом. Хроматограмма эфирных масел после обработки проявителем (ванилин) представлена на рис.    .

 

 

Рис. Хроматограмма 10 эфирных масел, проявление ванилином.

http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/104

   

Таким образом, для проведения ТСХ  необходимо:

• Нанести анализируемую смесь (0,5 – 5,0 мкл) и стандартные вещества на линию старта
• Подготовить хроматографическую пластинку
• Поместить пластинку в герметичную хроматографическую камеру с растворителем (элюентом)
• После достижения элюентом линии финиша извлечь пластинку из камеры, высушить растворитель
• Проявить хроматограмму известными методами

Процесс хроматографирования  по стадиям и во времени представлен на рис.    .

Рис. Основные стадии ТСХ смеси двух

http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/104

 

Рис. Развитие процесса хроматографирования  во времени

 

Методы качественного и полуколичественного анализа

 

Качественный анализ осуществляют сравнением времен удерживания пятен, полученных при хроматографировании смеси веществ, и времен удерживания стандартных веществ-свидетелей.

 

Метод определения площади  пятна.   После обработки пятен проявляющим реагентом определяют их площади. По площади можно судить о содержании какого-либо компонента в смеси. Сущность метода заключается в сравнении размера пятна (а также сопоставлении их интенсивностей) с размерами серии пятен этого же вещества с известными концентрациями (стандартные растворы). На пластинку наносят серию растворов стандарта с известными концентрациями вещества. Получают хроматограмму с пятнами разной площади, которая пропорциональна концентрации. Строят калибровочный график в координатах:                 S_пятна = f(С_{вещества}). Затем хроматографируют анализируемую смесь веществ. Из хроматограммы находят площадь соответствующего пятна. По калибровочному графику определяют концентрацию вещества. Метод является полуколичественным. Прост в исполнении, обеспечивает правильность определения 5-10% при содержании вещества в смеси 1-5 мкг.

 

                  

Рис.  Полуколичественный метод  определения концентрации вещества с использованием калибровочного графика

 

Необходимость получения более достоверного результата количественного определения привела к использованию инструментальных методов.

 
Метод элюирования. Этот метод заключается в том, что пятна разделенного вещества смывают с сорбента растворителем и определяют его концентрацию другими методами, например, фотометрическим или полярографическим. Это достаточно точный метод, но только при условии количественного выделения разделенного вещества. Из-за высокой трудоемкости метод используется достаточно редко и неприемлем при большом количестве исследуемых образцов.