Очистка БАВ

Хемосорбция — поглощение веществ с образованием химических соединений. К хемосорбции относятся ионный обмен,аффинная и гидрофобная хроматография. В производстве БАВ растительного и животного происхождения и на основе биосинтеза в основном используют адсорбцию.

Сорбционные процессы.

Сорбционный процесс выделения веществ из раствора смеси веществ представляет собой единство процессов сорбции и десорбции. Процесс десорбции разделен на два этапа: собственно десорбцию, т. е. получение элюата, содержащего целевой продукт, и регенерацию, т. е. удаление из сорбента всех сорбировавшихся веществ, позволяющих вернуть сорбент вновь на стадию адсорбции.

Рациональный выбор адсорбентов, растворителей и условий их применения для получения веществ из растворов должен базироваться на следующих положениях.

 

1.  Адсорбент и условия адсорбции должны быть выбраны так, чтобы они обеспечивали преимущественную и максимальную сорбцию извлекаемого вещества и его минимальную остаточнуюконцентрацию в растворе в условиях равновесия.

2.  Десорбирующий растворитель и условия десорбции должен быть выбран так, чтобы в условиях равновесия элюат с относительно высокой концентрацией вещества находился бы в равновесии с адсорбентом с малым содержанием вещества, т. е. чтобы адсорбция из десорбирующего растворителя была бы минимальной.

Следует отметить, что оба эти условия неотделимы друг от друга и. следовательно, выбранный адсорбент должен обеспечивать их выполнение.

В случае сорбции на молекулярных сорбентах осуществление первых двух условий ведения адсорбционных процессов при выделении веществ из растворов сводится к подбору адсорбента и условий его использования, которые обеспечили бы резкое различие в адсорбционных потенциалах из водного раствора и десорбирующего растворителя.

При подборе таких условий можно исходить из теории Поляни. По отношению к растворам адсорбционный потенциал растворенных веществ в данном случае выражается уравнением:

Согласно Поляни адсорбированный объем сорбента всегда полностью заполнен адсорбируемым веществом и растворителем. При адсорбции растворенного вещества оно вытесняет из адсорбционного объема часть растворителя. Поэтому чем больше адсорбционный потенциал растворителя, тем меньше величина сорбции растворенного вещества.

При выборе молекулярного сорбента для целей выделения веществ из растворов важную роль играет так называемое правило «уравнивания» полярностей, установленное Ребиндером. Согласно этому правилу адсорбция неполярных веществ на неполярных поверхностях будет успешно происходить из полярных растворителей, адсорбция полярных веществ на полярных адсорбентах — из неполярных растворителей.

В качестве адсорбентов в технологии лекарств применяют пористые твердые вещества с большой удельной поверхностью, наиболее распространенными являются: алюминия оксид, силикагель (гель кислоты кремниевой), уголь активированный, кизельгур, полиамиды, полиакриламиды, сефадексы, целлюлозы и др.

Адсорбцию проводят в специальных аппаратах — адсорберах, простейшим из них является вертикальный цилиндрический аппарат периодического действия, заполненный адсорбентом. Вначале через адсорбент пропускают раствор и насыщают его поглощающим веществом, затем фильтруют десорбентрастворитель или смесь растворителей, вытесняющую поглощенное вещество.

Для проведения непрерывной адсорбции применяют установки из нескольких адсорберов периодического действия, в которых попеременно происходят адсорбция и десорбция.

Адсорбционно-хроматографические методы

 

 Эти методы широко внедряются в производство ферментов, гормонов, рекомбинантных ДНК; для получения БАВ растительного и животного происхождения, к чистоте которых предъявля особенно жесткие требования, традиционная технология очистки не подходит. В промышленном производстве успешно себя зарекомендовала распределительная хроматография, самый надежный и эффективный метод очистки. В настоящее время широко используют непрерывную колоночную и ступенчатую хроматографию. В таблице приведены несколько известных хроматографических методов, основанных на различных параметрах разделяемых молекул.

Виды хроматографии	Используемые свойства молекул
Ионообменная	Заряд
Гель-фильтрация	Размер
Гидрофобная	Полярность
Аффинная	Структура

 

 

 

 Ионообменная хроматография.

Хроматография БАВ с помощью ионообменных сорбентов, называемая ионообменной, является одним из методов разделения, имеющих наибольшую продолжительную историю развития. В настоящее время промышленная ионообменная хроматография стала одной из важнейших технологических стадий получения коммерчески значимых количеств БАВ.

В основе ионообменной хроматографии лежит реакция обмена между неподвижным твердым ионообменным сорбентом и растворенным в растворителе веществом.

 

 Ионообменные материалы.

Ионообменные сорбенты представляют собой нерастворимые в воде вещества, синтетические или природные, содержащие в своей структуре ионогенные группы кислого (катиониты) или основного (аниониты) характера. Входящие в состав ионогенных групп ионы водорода (в случае содержания катионитов) или ионы гидроксила (в случае содержания анионитов) могут обмениваться с находящимися в растворе катионами или анионами по реакциям, образуя солевые формы ионитов:

R – Н + Ме+ <=> R – Me + Н⁺;

R – ОН + Анион-«=» R – Анион  + ОН-,  

где R — высокомолекулярный анион катионита или высокомолекулярный катион анионита.

При взаимодействии катионитов в Н-форме  с растворами оснований, а анионитов  в ОН- форме с растворами кислот также происходит солеобразование в фазе ионита наряду с нейтрализацией растворов путем образования воды по реакциям:

R – Н- + МеОН= R – Me + Н₂0;

R – ОН + Н – Анион =R-Анион  + Н₂0.

Таким образом, катиониты в Н-форме  представлены нерастворимыми кислотами, а аниониты в ОН-форме — нерастворимыми основаниями.

 

 Гель-фильтрация

Гель-фильтрация, или хроматография на молекулярных ситах позволяет разделять вещества с различными молекулярными массами. В этом случае насадка колонки состоит из частиц геля с определенным диаметром пор. Если размер молекул больших диаметра пор, то они не могут диффундировать в гель и быстро проходят через колонку, тогда как молекулы меньшего размера проникают в гель и поэтому движутся более медленно  В качестве сорбентов обычно используют сефадексы 6₂₅, G₇₅, G₁₀₀, состоящие из полимерных цепей полисахарида декстрана, соединенные через определенные промежутки поперечными связями и образующие своеобразные молекулярные сита. В химико-фармацевтической промышленности более широкое применение находят сефадексы G_2S, G₅₀ в виде гранул с диаметром пор 100— 30 мкм и 20—80 мкм соответственно. Проницаемость мембран для каждого из веществ смеси определяется величиной молекулы. В этой связи гель-хроматографию иногда называют молекулярным просеиванием. Определенный объем растворителя вымывает из колонки вещества с большей молекулярной массой (сефадексы G₂₅)_: и с меньшей молекулярной массой (сефадексы G₂₅, G_g0).

Основной величиной, измеряемой в  гель-хроматографии, является удерживаемый объем V_e:

V_e=V₀ + K_d*V_p, _где V₀ и V_p — объемы подвижной и неподвижной хроматографических фаз;

K_d — коэффициент распределения, который зависит от соотношения размеров молекул и пор.

Гель-фильтрация — метод, малочувствительный к составу образца, используется в основном при удалении осадителя, замене буфера и обессоливании.

Гидрофобная хроматография

Метод гидрофобной хроматографии используют для разделения БАВ на основе гидрофобных свойств, характерных для биологических объектов.

В основе механизма селективности при гидрофобной хроматографии лежит проявление так называемого гидрофобного эффекта, а также модуляция электровалентных взаимодействий, вследствие понижения локальной диэлектрической постоянной 
среды при введении неполярных радикалов или понижении активности растворителя.

Гидрофобная хроматография реализуется  в виде нескольких различных процессов. В наиболее часто встречаемом  варианте сорбция амфильных соединений гидрофобными сорбентами осуществляется из разбавленных водных растворов при низких значениях, рН (2,0—4,0), а элюация — путем снижения так называемой элюатропной силы подвижной фазы, достигаемой изменением рН, уменьшением полярности элюента (при добавлении спиртов, детергентов и других органическихмодификаторов). Этот вид хроматографии получил название обратнофазной (ОФХ).

Аффинная хроматография.

Интересным хроматографическим методом является аффинная хроматография, основанная на нативной специфичности некоторых биополимеров, особенно если они содержатся в культуральной жидкости в небольших концентрациях — менее 1 мкг/мл. В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом.

Между аффинной хроматографией и другими более традиционными методами адсорбционной или ионообменной хроматографии существуют значительные различия. В традиционных хроматографических методах сначала адсорбируются все компоненты смеси, а их разделение осуществляется на стадии десорбции посредством, например, замены концентрации элюента, или концентрации солей в элюенте, или постепенном повышения рН элюента. Напротив, специфичность аффинной хроматографии определяется в основном на стадии сорбции. Поэтому в аффинной хроматографии через колонки целесообразно пропускать раствор разделяемой смеси в течении достаточно длительного промежутка времени, пока не будет достигнуто насыщение неподвижной фазы, так как в нее адсорбируются практически только выделяемые соединение Таким образом, проведение разделения БАВ в аффинной хроматографии приближается к обычной сорбции в неподвижно слое вплоть до насыщения слоя адсорбента и резко отличается о обычного разделения многокомпонентной смеси, вводимой колонку однократно в виде концентрированного раствора.

В этом методе хорошее разделение достигается за счет специфического взаимодействия между иммобилизованным агентом и растворенным веществом. Показаны три стадии: ввод смеси веществ а, разделение б; элюирование, связанное с неподвижной фазой компонента смеси.

 

 Биоспецифическая хроматография

Сущность метода биоспецифической хроматографии состоит в том, что между одним или ограниченным числом белков-ферментов из множества имеющихся в фракционируемой смеси и полимерным сорбентом образуется довольно стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нерастворимый сорбент, что повышает его селективность.

Высокая селективность биоспецифических сорбентов обеспечивается тем, что в качестве лигандов используются вещества, специфически взаимодействующие с активным центром выделяемого фермента. Центром связывания служат присоединительные к полимерным матрицам субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, обычно называемые лигандами.

Таблица Примеры сродства биологических молекул

Очищенные  препараты	Лиганды
Ферменты	Субстратный аналог, ингибитор, антиген, вирус, антитела
Гормоны, витамины	Рецептор, белок-переносчик

Вторым компонентом биоспецифического сорбента является полимерная матрица, к которой присоединяется лиганд. Матрицей может быть любой полимер, в той или иной степени удовлетворяющий следующим требованиям:

— крупнопористость гелевой структуры;

—  гидрофильность, обеспечивающая хорошее взаимодействием  ее с водой и отсутствие неспецифического связывания белков  гидрофобным центрам;

— отсутствие в структуре заряженных групп;

— способность  полимера легко активироваться определенным химическими агентами,

Указанным требованиям отвечают: синтетические  полимеры  полиакриламиды, сфероны, а также крупнопористое стеклосиликагели,

Обычно  хроматографический процесс состоит из последовтельно меняющихся этапов сорбции, удаления несорбированным белков и элюации сорбированных ферментов.

Большие перспективы  открывает использование моноклоналных антител для приготовления аффинный гелей. Достаточно 4,0—5,0 антител, чтобы приготовить 1 л аффинного геля. Такие гели успешно применяют для выделения из среды культивирования животных клеток, например, гормона роста человека – самототропина и интерферона.

Направленный  синтез биоспецифически сорбентов и выбор режимов аффинной хроматографии позволяет добиться таких высоких степеней очистки БАВ, которые недостижимы для других хроматографических приемов. За одну стадию степень очистки может достигать 10²—10³ раз.

По своей  природе аффинная хроматография  является вариантом адсорбционной  хроматографии и ее основные закономерности близки обратнофазной и другим видам адсорбционной хроматографии. Используя уравнение

V_e=K_dV_p + V₀ =_УрЩ ₊ У₀, ^KD

можно показать, что удерживание БАВ происходит только при условии [Р₀] > Кр, когда концентрация иммобилизованного аффината [Р₀] больше константы диссоциации комплекса фермент—аффинат, например, относительное удерживание V_e =V₀ ?= 10 при [Р₀] = 1 ммоль/л возможно при величинеконстанты диссоциации K_D ~ 10^-4моль/л. Очевидно, что при использовании аффинатов с большей величиной K_D необходимо повышать концентрацию иммобилизованного аффината. Наоборот, при использовании аффинатов с очень малыми величинами K_D можно получить эффективно удерживающие сорбенты даже при небольших концентрациях аффинатов.