Методы оценки эффективности репеллентных композиций по отношению к двукрылых кровососущим

На втором этапе проводят более точное определение репеллентной (или другой) активности веществ.

Методы определения активности и эффективности анализируемых средств при проведении исследований действующих веществ этих средств и препаративных форм при их разработке, изучении и регистрации включает в себя:

• определение репеллентной и прочих видов активности;

• оценку эффективности  данных средств в различных препаративных       формах, включая аэрозольные и пиротехнические; репеллентных средств различного применения.

В целях получения сравнимых  данных при проведении экспериментов  используют стандартные, чувствительные к репеллентам культуры двукрылых кровососущих, выращенные в инсектарии. Для опытов отбирают однородные партии насекомых определенного возраста и пола. В зависимости от целей экспериментов можно использовать природные популяции кровососущих [2].

В источнике [2], при изучении биологической активности используют, как правило, следующих представителей: комары - pp. Anopheles, Aedes, Culex.

Личинки II, III или начала IV возраста, развивающиеся в водопроводной  дехлорированной воде, отстоянной в течение 24 ч; имаго - самки 5-дневного возраста, накормленные сахарной водой за 3 ч до опыта.

Методы оценки инсектицидного действия  препаративных форм

Метод принудительного  контакта насекомых

с обработанными  поверхностями

Поверхности разных типов - пластины размером 10×20 см из стекла, фанеры, неокрашенной или окрашенной масляной краской, линолеума и других материалов – обрабатывают раствором вещества или рабочими жидкостями, изготовленными из препаративных форм (концентраты эмульсий, суспензий, смачивающиеся порошки,гели и др.).

Для обработки поверхностей пластин, не впитывающих жидкость (стекло), используют 50 мл/м² рабочей жидкости, для обработки поверхностей, впитывающих жидкость (фанера) - 100 мл/м². Растворы наносят на поверхность путем распыления из распылителя. Контакт насекомых с обработанными пластинами проводят только после полного испарения растворителя с пластин - не ранее чем через 3 ч.При испытании инсектицидных карандашей (брусков и т. п.), репеллентных гелей ими обрабатывают стеклянные и фанерные пластинки. Количество ДВ, находящееся на пластинке, вычисляют путем взвешивания пластинки до обработки и после нее. Расчет ДВ проводят на 1 м².

Для контакта насекомых с  обработанными пластинами используют два типа экспозиметров:

• Набокова, представляющие собой стеклянный цилиндр высотой 13 - 15 см, диаметром 3,5 -4,0 см;

• (стеклянные) высотой 8 - 10 см, диаметром 8 - 9 см, применяемые в международной практике для тестирования инсектицидных средств.

На одну обработанную пластину помещают 1 - 2 экспозиметра с насекомыми [2].

В патенте [3] описан следующий эксперимент: проводили контактирование имаго комаров в пластмассовых экспозиметрах - конусах, с обработанными инсектицидами поверхностями. Внутренний диаметр конуса - 85 мм у основания, высота - 55 мм. Конусы сделаны из прозрачного гладкого пластика. В отверстие на вершине конуса запускали самок комаров с помощью стандартного аспиратора с загнутым концом (диаметром 10 мм).

Комары оставались в экспозиметре в течение 30 мин. Опыты ставили  в 3 повторностях, в каждой использовали по 10 насекомых. Опыты сопровождались  контролем, в котором насекомые контактировали  с поверхностями, обработанными растворителем.

По результатам опытов высчитывали показатели СК50 (СД50), СК95 (СД95), СК99 (СД99).

Комаров после контакта с  обработанными пластинами переносили  в чистые пластиковые стаканы  и регистрировали  состояние (парализованные, мертвые) в течение 24 - 48 ч.

С целью изучения остаточного  действия веществ (препаратов) пластины обрабатывали в дозировках (минимальных), которые в предыдущих опытах обеспечивали гибель 99 - 100 % насекомых.

Контакт насекомых с обработанной поверхностью проводили  раз в 5 - 10 суток до тех пор,пока гибель насекомых  составит менее 70 %.После этого  поверхность  считали утратившей инсектицидные  свойства. Длительность остаточного  действия выражали в сутках от даты обработки тест-поверхности.

Изучение  раздражимости  комаров.

 

Автором работы [4] была изучена разражимость комаров, которая  является  важным показателем репеллентного и инсектицидного воздействия  испытываемой  формы.

Аппарат для определения  раздражимости представляет собой  светонепроницаемую камеру из легкого дерева размером 135×135×90 мм. Свет проникает в нее сквозь круглое отверстие в задней стенке диметром 90 мм, по бокам которого имеются пазы для матового стекла с нанесенным на него инсектицидом (или контрольного) и конического экспозиметра (те же конусы, что и для определения продолжительности действия инсектицида). Опыты проводят в темной комнате с единственной электрической лампочкой, помещаемой перед задней стенкой прибора на расстоянии, зависящем от мощности лампы: 40 Вт - 41 см, 60 Вт - 55 см, 100 Вт - 92 см.

 В ходе эксперимента  комаров в садке перед опытом  содержали в той же комнате при том же освещении (т. е. расстояние от лампы) в течение 0,5 - 1 ч. Каждого комара (сытых самок) сначала сажали в контрольный экспозиметр (та же бумага, но без инсектицида), где выдерживали 3 мин, а затем в течение 10 мин подсчитывали число взлетов. Комары, взлетевшие в контроле 2 и более раз, выбраковываются как спонтанно раздражимые.

Спокойных комаров (не было взлетов или 1 случайный взлет без ползания по бумаге) по одному пересаживали в опытный экспозиметр с бумагой, обработанной инсектицидом, и после 3 мин начинали подсчет взлетов, продолжающийся 10 мин. Отмечали «хождение» комара по бумаге, что также говорит о раздражимости.

В опыте было использовано не менее 50 особей. По окончании опыта подсчитывали  распределение особей по степени раздражимости.

Методы изучения репеллентной активности веществ

 

Выше были  описаны  некоторые  методы  оценки инсектикцидного  действия анализируемых форм, а также  веществ, входящих в  их состав. Эти  методы   используются наряду с  методами оценки репеллентной  активности.

Отбор веществ, обладающих репеллентной активностью, проводят в два этапа: на первом этапе определяют уровень репеллентной активности в сравнении с эталоном, которым является диэтилтолуамид (ДЭТА) в аналогичных концентрациях, на втором этапе изучают спектр репеллентного действия веществ в разных концентрациях по отношению к различным видам насекомых.

Как правило, при  разработке какой-либо формы (геля,эмульсии и т.д.), обладающей репеллентной активностью, в её рецептуру эфирные  масла  различных растений, которые  обладают  отпугивающим действием по отношению  к насекомым.

Так,  в патенте [5]  приведен перечень эфирных масел, обладающих данным действием. Некоторые представители данного списка: бергамотное масло, масло березового дегтя, пихтовое масло, масло шишек пихты, еловое хвойное масло, гераниевое масло, грейпфрутовое масло, сосновое хвойное масло, лавандовое масло, лемонграссовое масло, гвоздичное масло, апельсиновое масло, масло шалфея, масло чайного дерева, кедровое  масло, цитронелловое  масло (цитронелла).

Определение репеллентной активности веществ по отношению  лабораторной культуре комаров методом  ольфактометрии

 

В источнике [4] описывается  метод ольфактометрии для определения репеллентной активности природных  и синтетеических  душистых  веществ.

На полоски фильтровальной бумаги или ткани (бязь) размером 2×6 см наносили 0,12 мл 5 – 20 %-ных растворов испытуемых соединений, 0,5 %-ных растворов душистых веществ. Тесты помещали в ольфактометр после их полного высыхания.

Для опытов использовался  ольфактометр, основная часть которого состоит из цилиндрической камеры высотой 12 см и диаметром 30 см. Камера имеет  по окружности 24 отверстия, в которые  впаяны трубки диаметром 2,5 см, длиной 6 - 8 см. Трубки имеют боковые отводки, а на конце Т-образные приемники, в которые через трубки вылетали насекомые.

 Один конец приемников  закрывали мельничным газом, другой - пробкой. Внутрь боковых отводов  трубок вкладывали полоски тестов, пропитанные раствором изучаемого  вещества. Внутри камеры имеется  подвижная цилиндрическая шторка  высотой 6 см, плотно прилегающая  к стенкам ольфактометра. При  движении шторки вверх-вниз одновременно  закрывались или

открывались боковые отверстия  приемников с изучаемыми веществами, позволяя или препятствуя комарам, находящимся в камере, залететь в трубки и реагировать на пары репеллентов. В приборе была использована реакция бегства насекомых при возбуждении и стремление их лететь к свету через трубки.

Ольфактометр помещали в  специально оборудованный бокс, где  поддерживают оптимальные для насекомых условия: температуру воздуха (26 ± 1) °С, относительную влажность 60 - 70 % и имеется постоянный источник света (лампа 150 Вт). В камеру ольфактометра помещают 500 голодных комаров, открывали, опуская шторку, боковые отверстия, включают электромотор и лампу, расположенную над камерой. Камера медленно вращалась вокруг оси для выравнивания освещения. Экспозиция 15 мин. За это время основная часть насекомых покидала камеру и распределялась по трубкам.

 Для подсчета насекомых,  находящихся в трубках, шторку  закрывали, а насекомых усыпляли  эфиром. Степень отпугивающего действия вещества определяли по числу комаров, залетевших в трубки с обработанными и контрольными полосками, и вычисляли КОД (формула 5).

При определении длительности отпугивающего действия обработанные полоски испытывали  каждые 3 - 5 суток вплоть до утраты ими репеллентных свойств, когда КОД становится ниже 70 %.

 При изучении быстро  испаряющихся веществ (эфирные  масла) опыты следует проводить  чаще (в отдельных случаях - ежедневно).

Определение репеллентной активности веществ по отношению  к природным популяциям кровососущих двукрылых методом ольфактометрии

 

В следующих опытах используют природные популяции кровососущих двукрылых, доминирующих в данной климатической зоне [4].

Конструкция ольфактометра  аналогична описанной выше, но его  размер и число трубок зависят  от того, сколько веществ одновременно исследуется и по

отношению к каким видам  насекомым. При проведении опытов на комарах и слепнях используют ольфактометр, состоящий из 12-канальной  камеры емкостью 1 л и Т-образных трубок диаметром 2,5 - 3,0 см, длиной 8 - 10 см. При проведении опытов на мошках и мокрецах используют ольфактометр с камерой объемом 0,5 л и трубками диаметром 1,5 и длиной 8 см.

Принцип работы ольфактометра  такой же, как и в лабораторных опытах. Полоски фильтровальной бумаги или бязи пропитывали изучаемым препаратом или раствором вещества. Поскольку отпугивающие свойства веществ и реакция на них насекомых изменялись под влиянием различных факторов, в каждый опыт обязательно включали эталон (ДЭТА) и контроль. Каждое вещество изучали в 3-х повторностях.

Контрольными служили полоски фильтровальной бумаги или бязи, пропитанные растворителем.

Насекомых для опытов собирали в ловушки или сачками. В ольфактометр помещали 500 мошек или мокрецов, 100 комаров или 50 – 100 слепней. В период постановки опытов регистрировали температуру, влажность воздуха,освещенность.

Коэффициент отпугивающего  действия (КОД) определяли по соотношению числа насекомых, залетевших в контрольные трубки и трубки с обработанными тестами (формула 5).

Соединения и препараты, у которых установлен широкий  спектр отпугивающего действия при КОД не менее 90 %, отбирают для проведения испытаний на обработанной ткани, которые рассмотрены далее.

Определение репеллентной активности веществ по отношению  к природным популяциям кровососущих двукрылых при обработке ткани

 

Полоски марли размером 20×50 см площадью 1000 см² пропитывали 10 – 20 %-ными спиртовыми растворами репеллентов из расчета 20 г на 1 м² ткани. При испытании концентратов эмульсий репеллентов марлю обрабатывали 10 - 20 %-ными эмульсиями, приготовленными из концентратов. При изучении эмульсий и лосьонов на полоску марли наносят 10 мл препарата. При изучении эффективности наполнителей аэрозольных баллонов марлю обрабатывали струей из баллона с расстояния 15 - 20 см, из расчета 15 - 20 г смеси на 1 м² ткани. Расход смеси определяли взвешиванием баллона до и после обработки.

Обработанные полоски марли развешивали  и подсушивали в течение суток.

Первое определение отпугивающего действия тестов проводили через сутки после

обработки, последующие - один раз в 3 - 5 дней. В промежутках между опытами тесты хранили в вертикальном положении на открытом воздухе под навесом в условиях, обеспечивающих свободное испарение вещества.

Испытания проводили в местах массового нападения кровососущих насекомых. До начала исследований и в период проведения опытов проводились учеты численности насекомых и их сбор (сачком) для определения доминирующих видов, регистрировались метеорологические факторы (температура и влажность воздуха, сила ветра, освещенность, давление). Интенсивность нападения кровососов на человека определяли путем подсчета числа насекомых, севших на обнаженное предплечье (голень) испытателя в течение 20 мин (4 раза по 5 мин) через каждый час в период суточной активности кровососущих насекомых.