IV. КАЧЕСТВЕННЫЙ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗ.
Функция хроматографической колонки
заключается в разделении сложной по составу
смеси на последовательно выходящие из
колонки бинарные смеси индивидуальных
компонентов с газом-носителем. Установление
природы разделяемых компонентов и тем
самым установление качественного состава
смеси осуществляется за пределами колонки
с использованием различных приемов в
зависимости от поставленной аналитической
задачи. В этой связи можно выделить следующие
основные задачи качественного анализа: •
отнесение к индивидуальным соединениям
пиков на хроматограмме смеси, состав
которой ориентировочно известен;
• выполнение группового анализа;
• полная идентификация компонентов.
Далее, в зависимости от характера поставленной
задачи, используемые приемы качественного
анализа подразделяются:
• на чисто хроматографические;
• на варианты, сочетающие газовую хроматографию
с другими физико- химическими методами
анализа, позволяющими решить поставленную
задачу. Из первой группы, группы чисто хроматографических
приемов наиболее часто используются
следующие:
• сравнение экспериментально установленных
значений параметров удерживания разделяемых
соединений с приведенными в литературе
значениями этих параметров для известных
веществ. Из широкого набора параметров
удерживания для целей идентификации
при сопоставлении с опубликованными
данными используют чаще всего относительные
параметры удерживания и индексы удерживания
Ковача. Установленные величины относительных
параметров удерживания сопоставляются
с табличными, и по результатам сопоставления
делается вывод о качественном составе
анализируемой пробы. В основе метода
идентификации по индексам удерживания
Ковача лежит использование линейной
зависимости между логарифмом исправленного
удерживаемого объема и числом атомов
углерода в молекуле нормальных углеводородов.
• получение для гомологических групп
веществ корреляционных зависимостей
типа параметр удерживания – физико-химические
характеристики вещества, при этом основными
способами идентификации являются следующие:
а) идентификация, основанная на использовании
величин относительных параметров удерживания
разделяемых веществ;
б) идентификация, основанная на зависимости
логарифма исправленного объема удерживания
разделяемых соединений от температуры
кипения вещества и температуры процесса
разделения.
• идентификация по эталонным веществам.
В хроматографической практике этот метод
получил название метод метки. Обычно
этот метод применяют для отнесения компонентов
анализируемой смеси к предполагаемым
соединениям и в простейшем варианте он
реализуется как метод добавки: сравниваются
две полученные в одинаковых условиях
хроматограммы – исходного образца и
образца с добавкой вещества-эталона.
Если на второй хроматограмме появился
дополнительный пик, это означает, что
в анализируемой смеси добавленное эталонное
соединение отсутствует. Если один из
пиков, имеющийся на первой хроматограмме,
увеличился в размере на второй, то, вероятно,
добавляемое эталонное соединение присутствует
и в анализируемой смеси. Однако следует
учитывать, что, если добавляемое эталонное
соединение входит в состав исследуемой
смеси, на второй хроматограмме увеличится
высота соответствующего пика, а ширина
пика у основания останется неизменной.
Если же одновременно имеет место и изменение
ширины пика у основания, то добавляемое
эталонное соединение относится к другому
классу соединений и имеет место простое
совпадение параметров удерживания этих
соединений.
• использование селективных детекторов
( например: масс-селективный детектор,
который при использовании баз данных
по спектрам масс позволяет решать вопросы
идентификации с высокой долей достоверности).
• реакционная хроматография- самостоятельное
направление газовой хроматографии, которое
характеризуется своими специфическими
методами, особой областью применения,
рядом особенностей аппаратурного оформления.
В отличие от других вариантов газовой
хроматографии в аналитической реакционной
газовой хроматографии эффективность
хроматографической колонки и чувствительность
детектирования, как правило, остаются
неизменными, однако в результате химической
трансформации анализируемой смеси образуются
новые соединения, что приводит в общем
случае к изменению коэффициентов разделения
и чувствительности детектирования. Во вторую группу методов идентификации
входят приемы, предусматривающие последовательный
препаративный сбор фракций, выходящих
из газохроматографической колонки, с
их последующим исследованием с использованием
подходящих физико-химических методов
анализа. Наибольшее предпочтение отдается
использованию методов масс- спектрометрии
и инфракрасной спектрометрии.
- КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
В газовой хроматографии хроматограмма
представляет собой графическое изображение
зависимости концентрации компонентов
в газе-носителе на выходе из колонки от
времени.
Хроматографический пик, соответствующий
индивидуальному компоненту пробы, отражает
изменение во времени концентрации этого
компонента в газе-носителе на выходе
из колонки и может быть охарактеризован
рядом параметров.
V.I. Параметры
пика как характеристика количества вещества.
Параметром хроматографического
пика называется величина, функционально
связанная с количеством соответствующего
данному пику вещества.
Эта величина может быть определена:
• путем измерений на полученной хроматограмме;
• путем непосредственной обработки выходного
сигнала детектора.
На практике используют три
основных параметра хроматографического
пика:
1) высота пика h;
2) произведение высоты пика h на время
удерживания t или пропорциональное ему
расстояние на хроматограмме от момента
ввода пробы до регистрации максимума
пика l, т.е. h t или h l;
3) площадь пика А или величины, приближенно
характеризующие ее значение.
Установлено, что для хроматограммы,
полученной в идеальных условиях, применение
любого из указанных параметров для количественных
определений должно давать одинаковые
результаты. Поскольку реальные хроматограммы
получаются в условиях более или менее
далеких от идеальных, то в зависимости
от конкретных условий анализа и применяемого
оборудования ценность того или иного
параметра пика может оказаться различной.
Основные критерии, которые определяют
ценность параметра в конкретных условиях,
можно сформулировать следующим образом:
• Простота и точность измерения величины
параметра. Так, например, полная площадь
пика в большинстве случаев является приемлемым
параметром. Однако измерение площади
на реальных хроматограммах обычно сопряжено
с большими затратами труда и времени
либо требует применения специального
оборудования, стоимость которого соизмерима
со стоимостью хроматографа. Поэтому такой
параметр стараются заменить другим. Связь
значения параметра с количеством компонента
в пробе должна быть максимально близка
к линейной, по крайней мере, в пределах
изменения концентрации определяемого
вещества в смесях, для которых методика
предназначена.
Параметр h
Параметр h рекомендуется применять
в следующих случаях:
• при работе с хроматографом, обеспечивающим
хорошую стабильность условий анализа
и высокую точность задания температуры
и скорости потока газа-носителя (желательно
использовать детектор по теплопроводности);
• при анализе сходных по составу проб
и при работе на непрерывно включенных
приборах, например, автоматических хроматографах,
установленных в потоке или в производственных
лабораториях при круглосуточной работе.
В этом случае линейность параметра достаточно
велика, поскольку пределы изменения содержания
компонентов незначительны;
• при выполнении быстрых анализов, когда
имеется возможность повторить измерения,
вызывающие сомнения;
• если есть возможность точно дозировать
пробу;
• если легко выполнить и проверить калибровку
прибора;
• при расчете хроматограмм, содержащих
плохо разделенные пики, приближенной
оценки результатов.
Параметр h не рекомендуется применять
в случаях:
• если калибровка прибора затруднена;
• при использовании потокового детектора.
• при использовании потокового детектора,
если скорость потока газа-носителя задается
и поддерживается недостаточно точно.
Параметр hl
Параметр hl рекомендуется использовать
в следующих случаях:
• для расчета хроматограмм, в которых
высота пика не искажена соседними пиками,
в том числе хроматограмм с неполностью
разделенными пиками;
• при использовании детектора по теплопроводности
или другого концентрационного детектора;
• для более точного, чем по параметру
h, расчета малых по высоте пиков;
• для расчета узких пиков, например, в
капиллярной хроматографии;
• для повторяющихся анализов, выполняемых
нерегулярно. Параметр hl не рекомендуется использовать
в случаях:
• если есть основания предполагать нелинейность
изменения высоты пика вследствие перегрузки
колонки или детектора в сочетании с потоковыми
детекторами;
• при анализе с программированием температуры;
• при определении веществ с очень малыми
или очень большими временами удерживания;
• при анализе смесей, дающих на хроматограмме
пики, сильно различающиеся по высоте
Параметр А
Площадь пика для детекторов,
используемых в количественной хроматографии,
является универсальным параметром, применимым
во всех случаях, когда отсутствуют необратимые
процессы в колонке и когда детектор работает
в области нормальных рабочих условий.
Методы измерения полной площади
пика можно подразделить на автоматические
и выполняемые вручную. Для измерения
полной площади пика вручную чаще всего
используют два способа: планиметрирование
и взвешивание вырезанных по контуру хроматограммы
пиков. Планиметрирование пиков обычными
планиметрами с достаточной точностью
удается осуществить лишь в случае широких
и больших по площади пиков. Поскольку
такие пики встречаются сравнительно
редко, этот метод не нашел применения
в количественной хроматографии. Вырезание и последующее взвешивание
пиков является довольно удобным и сравнительно
точным методом определения полной площади
пика и рекомендуется для особо трудных
измерений, в частности, для сильно асимметричных
и перекрывающихся пиков. Недостатком
этого метода является то, что он требует
сравнительно больших затрат труда и разрушает
хроматограмму. Для устранения последнего
недостатка и одновременно повышения
точности измерений предложено вырезать
и взвешивать копию пика на металлической
фольге.
Рассмотрим следующие приближенные
методы вычисления площадей пиков:
• Произведение высоты пика на ширину
пика на половине высоты (hb). Этот метод
приближенного вычисления площади получил
настолько широкое распространение в
практике, что часто площадь пика отождествляется
с произведением hb.
• Произведение высоты пика на среднее
значение ширины пика, измеренной на нескольких
уровнях. Частным случаем этого способаявляется
метод Кэндала−Боша: вычисление произведения
высоты пика на полусумму значений ширины
пика, измеренных на уровнях 0.15 h и 0.85 h.
• Разбивка на простые фигуры (трапеции,
прямоугольники, треугольники).
• Измерение площади треугольника, образованного
пересечением касательных в точках перегиба
кривой. Иногда этот метод называют методом
описанного треугольника.
• По первой производной профиля хроматографического
пика.
Из автоматизированных программных
продуктов регистрации и обработки хроматограмм
следует отметить Юнихром, Мустанг и разработанную
на кафедре аналитической химии Белорусского
государственного университета автоматизированную
систему спектрального анализа (АССА).
V.II.Методы количественного анализа в
хроматографии
• метод внутренней нормализации :
сумма площадей всех хроматографических
пиков анализируемой смеси приравнивается
100 % и по величинам площадей отдельных
компонентов определяют их процентное
содержание в анализируемой смеси. Таким
образом, этот метод позволяет установить
лишь относительное содержание компонентов
в разделяемой смеси.
•метод абсолютной калибровки (внешнего
стандарта). Он обычно предполагает построение
градуировочного графика по стандартным
смесям, как и в других физических методах.
•метод внутреннего стандарта
предусматривает введение в анализируемый
образец известного количества эталонного
соединения, хроматографирование полученной
смеси и расчет по формуле:
сi(%) = ──kс
(2),
где сst - концентрация внутреннего
стандарта введенного в пробу, k - поправочный
множитель, который рассчитывают по стандартной
смеси эталонного соединения и определяемого
вещества.
•метод стандартной добавки позволяющий
учесть влияние матрицы, заключается в
том, что к анализируемой смеси несколько
раз добавляют различные известные количества
того компонента (в чистом виде), содержание
которого следует определить. По полученным
данным строится график зависимости площади
пика от величины добавки. Содержание
компонента в исходной анализируемой
смеси соответствует величине площади,
определяемой экстраполяцией на нулевую
добавку.
- Области применения газовой
хроматографии.
Газовая хроматография используется
во многих областях медицины: в гигиене
и экологии для определения содержания
вредных примесей в воздухе, воде и пищевых
продуктах; в токсикологии и судебной
медицине для диагностики отравлений
техническими жидкостями (хлорпроизводными
углеводородов, алкоголем и его суррогатами)
и пестицидами самой различной структуры;
в фармакологии и фармации для контроля
качества препаратов, исследования метаболизма
лекарственных средств.
Традиционные пути идентификации
микроорганизмов – возбудителей инфекционных
заболеваний или гнойно-воспалительных
процессов включает в себя несколько этапов:
посев биологического материала, на питательные
среды, затем получение чистых культур,
выращивание их на средах обогащения и
лишь затем их идентификацию по характеру
разрушения тех или иных субстратов даже
для микроорганизмов, обладающих способностью
к быстрому росту, эти этапы исследования
занимают не менее двух суток. С помощью
газовой хроматографии можно проводить
ускоренную (менее двух часов) идентификацию
микроорганизмов по спектру специфических
компонентов их мембран или по специфическим
продуктам пиролиза.
Особенно следует подчеркнуть важное
применение газовой хроматографии в изучение
запаха – постоянного спутника любого
биологического объекта, который как “аура”
окружает его и по всей вероятности несет
очень важную информацию о нем и отражает
своим качественным и количественным
составом внутреннее состояние организма,
процессы происходящие в нем.
В этой связи хроматография запаха возможно
приоткроет многие тайны, касающиеся жизнедеятельности
человека и его здоровья.