Колоночная хроматография: основные принципы ведение работы

Хроматографические  методы анализа. Хроматография

Хроматография - это не наука, а - искусство!  
Народная мудрость.

 
Хроматография [гр. сhrömatos − цвет + graphö − пишу] — метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной.

Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа  является возможность разделения близких  по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси  можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими  методами.

История метода: 

Хроматографический метод  анализа был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichteder Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа — прибора для осуществления процесса хроматографии. В 1910-1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.

Хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа многокомпонентных систем, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного (в т. ч. промышленного) выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов.

В некоторых случаях для  идентификации веществ используется хроматография в сочетании с  другими физико-химическими и  физическими методами, например с  масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др.

Основные  достоинства хроматографического  анализа:

• экспрессность; высокая эффективность; возможность автоматизации и получение объективной информации;
• сочетание с другими физико-химическими методами;
• широкий интервал концентраций соединений;
• возможность изучения физико-химических свойств соединений;
• осуществление проведения качественного и количественного анализа;
• применение для контроля и автоматического регулирования технологических процессов

Основные  виды хроматографии:

• Жидкостная хроматография:

• Колоночная хроматография
• Тонкослойная хроматография
• Высокоэффективная жидкостная хроматография

• Газовая хроматография

• Ионообменная хроматография
• Бумажная хроматография
• Гель-фильтрационная хроматография
• Аффинная хроматография 

Таблица 1. Различие видов  хроматографии.

Общие черты различных видов хроматографии:

Все хроматографическиеметоды анализа характеризуются общими чертами:

• Проведение хроматографического анализа включают стадии:

1. Введение разделяемой смеси в систему;

2. Разделение смеси одним из вида хроматографии;
3. Сбор фракции;
4. Анализ фракции;

• Разделяемые вещества имеют хроматографическую характеристику – время удержания T_R (время, нахождения соединения в колонке от его загрузки до выхода (когда достигается максимальная концентрация в анализируемых фракциях)) или R_f (отношение пути, пройденного веществом, к пути, пройденного растворителем) для бумажной или тонкослойной хроматографии

Колоночная хроматография

Колоночная хроматография, как адсорбционная, так и распределительная, является простым и удобным методом  разделения смеси веществ.

      Представляет собой стеклянную трубку, один из концов которой имеет пористую насадку или заткнут кусочком ваты, для того чтобы сорбент не высыпался. Длина колонки зависит от Rf разделяемых веществ. Чем меньше разница в Rf – тем длиннее колонка (слой сорбента). Пример: для разделения 2-х веществ с разницей в Rf -0,4 требуется колонка около 10 см. Ширина колонки зависит от количества (г) разделяемой смеси. Чем больше количество – тем шире колонка. Пример: для разделения – 0,5 грамма смеси 2-х веществ с разницей в Rf – 0,4 требуется колонка около 2,5 см шириной.

     Описанный выше метод адсорбционной колоночной хроматографии называется элюентным анализом. Как уже указывалось, при элюентном анализе подвижную жидкую фазу пропускают через колонку до тех пор, пока все зоны, образованные компонентами образца, не выйдут из колонки. Метод можно изменить, применяя последовательно несколько различных растворителей, подобранных таким образом, что каждый следующий является более эффективным элюирующим (вымывающим) агентом. Это позволяет ускорить процесс разделения смеси.

Для удовлетворительного  разделения компонентов смеси важно  соблюдать ряд условий при  проведении анализа. Колонка не должна быть «перегружена» анализируемым  веществом, т.е. размер пробы, загружаемой  в колонку данного размера, ограничен. Рекомендуется использовать 25-50 г адсорбента на 1 г адсорбирующего материала при хорошей адсорбции и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией.

Выбор правильного  сорбента.

Успех хроматографирования  на колонке зависит главным образом  от правильного выбора сорбента и  подвижной фазы. Полярные сорбенты (например, окись алюминия) хорошо сорбируют  полярные органические вещества из неполярных растворителей. Такие полярные вещества легко вытесняются из колонки  полярным растворителем. Сорбенты классифицируют по их относительной полярности и  емкости (т.е. способности сорбировать  определенное количество вещества). Одним  из наиболее распространенных сорбентов, используемых в колоночной хроматографии, является силикагель. По величине pH водной суспензии силикагель относят к слабокислым сорбентом. Обычно используют технический силикагель, содержащий 10-20% воды, хотя максимальная активность силикагеля достигается после нагревания в течение нескольких часов при 150-160 С. На силикагеле хорошо разделяютсяалкалоиды, сложные эфиры Сахаров, глюкозиды, липиды, глицериды, стероиды,аминокислоты. Использование метанола и этанола в качестве подвижной фазы снижает активность силикагеля.

Окись алюминия для хроматографии бывает основная, нейтральная и кислая. Кроме того, в зависимости от содержания воды (от 0 до15%) различают 5 степеней активности окиси алюминия. Наиболее активную (сухую) окись алюминия получают прокаливанием при 400-450 С. В колоночной хроматографии обычно используют основную и нейтральную окись алюминия. На ней хорошо разделяются спирты, углеводороды, стероиды,алкалоиды, природные пигменты, витамины и сложные эфиры. Надо иметь в виду, что окись алюминия может инициировать многие реакции (конденсации, полимеризации и др.). При использовании окиси алюминия нельзя применять в качестве элюентов ацетон и этилацетат.

Существует несколько  разновидностей препаративной колоночной хроматографии, которые различаются  по типам колонок и особенно по методам пропускания элюирующего  растворителя: колоночная хроматография  с «гравитационным элюированием», (т.е. под действием собственной  силы тяжести), более быстрые и  эффективные флеш-хроматография, хроматография  среднего давления и флеш-хроматография  на сухой колонке.

Подвижной фазой, обычно называемой «элюирующии растворитель» или  «элюент», является органический растворитель типа гексана или петролейного эфира. Разделяемая смесь с помощью  растворителя помещается в верхнюю  часть колонки, где она сорбируется  неподвижной фазой, а затем через  колонку непрерывно пропускают элюент. Каждый компонент смеси переносится  вниз по колонке элюентом со скоростью, которая зависит от его сродства к сорбенту. В идеальном случае смесь разделяется на отдельные  компоненты (слои), которые медленно опускаются вниз и в конечном итоге  собираются в приемник.

Обычно элюент собирают порциями. Каждую порцию проверяют с помощью (ТСХ) на присутствие того или иного  компонента смеси. Затем соответствующие  порции объединяют, удаляют растворитель на роторном испарителе и выделяют соединение.

Требования к  сорбенту.

1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента. Пример: разделение и очистка ацетата на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральномAl₂ O₃ их удается эффективно очистить.
2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту ( от полярного сорбента к неполярному и наоборот). Пример 1: Rf =0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой. Пример 2: Rf=1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости,амины) на сорбентах с обращенной фазой.

Приемники фракции. Для сбора фракции можно использовать как обычные плоскодонные колбы (А), так и пробирки (Б). Когда разделяемые вещества окрашены, видно как они выходят с колонки. Каждое вещество собирают в отдельный приемник. Если вещества выходят смесью – смесь собирают отдельно. Если разделяемые вещества не окрашены, ведут сбор фракции определенного объема, который зависит от размеров колонки и от степени разделения веществ (Rf). Пример: обычно при делении 0,2 г исходной смеси собирают по 7-10 мл фракции, при делении 2-3 г по 20-25 мл.

Требования к  элюенту.

1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться при его присутствии.

2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после выделения веществ (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).

3. Элюент подбирают таким образом, чтобы на тонкослойной хроматограмме смеси (желательно на том же сорбенте), Rf продуктов различался не менее 0,15 и пятна выходили с Rf не более 0,5-0,6 после одного прогона хроматограммы.

Добавление элюента. Элюент добавляется или непосредственно, или при помощи капельной (делительной) воронки. Важно! При проведении хроматографирования слой сорбента ни в коем случае не должен пересыхать, иначе может произойти его растрескивание, приводящее к снижению разделяющей способности.

Заключение

Таким образом, мы ознакомились:

• Видами хроматографии;
• Основными достоинствами;
• Общими чертами и различием;
• О колоночной хроматографии;
• О выборе правильного сорбента (т.е. о силикагеле и окиси алюминия)

Думаю, что доклад был  интересным и полезным и поможет  всем нам в  дальнейших работах. Благодарю  за внимание! 

ИСТОЧНИКИ И ЛИТЕРАТУРА:

1. Морозов А.А. Хроматография в органическом и неорганическом анализе. М. Высш.шк., 1972,233 с.;
2. Лабораторное руководство по хроматографическим методам. В 2 т. Под ред. О. Микеш. М.: мир, 1982, т. 1-2, 783 с.;
3. Жуховицкий А.А., Туркельтауб Н.М. Колоночная хроматография. М.: Гостоптехиздат, 1962, 240 с.;
4. Патенты Российской Федерации с сайта www.findpatent.ru
5. Сакодынский.И., Киселев А.В., Иогансен А.В. и др. Физико-химическое применение хроматографии. М.: Химия, 1973, 254 с.;
6. Хроматографический анализ окружающей среды. Под ред. Р. Гроба. М.: мир, 1979, 606 с.;