Эксклюзионная хромотография

Министерство образования  и науки Республики Казахстан.

Карагандинский Университет  «Болашак»

Кафедра Фармацевтических дисциплин

 

 

 

 

 

СРС

на тему:

«Эксклюзионная Хроматография»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приготовил: студент III курса

группы ФМ-09-1

Нурашев А. К.

Проверила: доцент, к.х.н.,

 Сиволобова О. А.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Караганда – 2012

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ситовая хро-матография), жидкостная хроматография, основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, к-рый служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент - орг. р-ритель) и гель-фильтрацию (элюент - вода).

Ддя эксклюзионной хроматографии используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для эксклюзионной хроматографии полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для эксклюзионной хроматографии гидрофильных полимеров -гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для эксклюзионной хроматографии высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Эксклюзионную хроматографию эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле произ-ва и стандартизации полимеров. Эксклюзионную хроматографию используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

При эксклюзионной хроматографии молекулы, имеющие в р-ре большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэф. распределения K_d, от к-рого зависит объем удерживания компонента V_R в колонке:

где V₀ - объем пространства между частицами сорбента, Vp -объем пор сорбента.

Эффективным размером макромолекулы  при эксклюзионной хроматографии является ее гидродинамич. радиус R, к-рый вместе с мол. массой полимера М определяет характеристич. вязкость полимера . Универсальную калибровочную зависимость V_R от произведения (ур-ние 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В - константы. Ур-ние (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров. Используя ур-ние Марка-Ку-на-Хувинка: где и а - табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с р-рителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

где, С2 = B(a+1).

Рис. 1. Универсальная калибровочная  зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии: - линейный полистирол; - разветвленный полистирол; (+) -звездообразный полистирол; - гетеропривитой сополимер полистирола и полиметилметакрилата; - полиметилметакрилат;- разветвленный полифенилсилоксан; -полибутадиен.

 

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для  к-рых известны М, и а, а также зависимость (3) для полимера с неизвестными константами, можно найти для него ,а и константы С₁ и С₂. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М)и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью

определяют ММР исследуемого полимера. Рис. 2.

Рабочая калибровочная зависимость  для эксклюзионной хроматографии. В области от V0до VT (объем колонки, доступный для р-рителя и молекул  ниже определенного размера, соответствующего Ммин) рабочая зависимость имеет  линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие  объемам V0 и VT мол. массы представляют собой пределы исключения - Ммакс (молекулы большого размера, не проникают  в поры сорбента) и Ммин, (молекулы небольшие, полностью проникают  в поры сорбента). Эти величины, а  также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости  селективности разделения С2 = Vp/lg(Mмакс/Mмин)и  степень ее линейности определяют качество сорбента для эксклюзионной хроматографии. Благодаря логарифмич. зависимости V от М селективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку  С2 = (d_V/d_M)M. Для разделения макромолекул с близкими М требуется сорбент, работающий в узком диапазоне М и обладающий высокой селективностью С2. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол.-массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 102,5 - 106,5. Селективность С2 подобного сорбента (или специально подобранной смеси сорбентов) естественно ниже, чем унимодального сорбента, но ее делают максимальной для заданного диапазона Макс. селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того,-оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах М_МИН - М_МАКС характерных для данного сорбента. Иначе по краям хроматограммы при VT и V0будут выходить из колонки макромолекулы соотв. с М М_МИНи М М_МАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм эксклюзионной хроматографии. Макромолекулы в р-ре представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и р-ром контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из р-ра в поры: где - изменение энтальпии макромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с пов-стью сорбента (матрицей геля); - уменьшение энтропии при переходе макромолекулы из р-ра в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда , a K_d, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.

В критич. условиях, когда  при переходе макромолекул из р-ра в  поры сорбента энергия Гиббса не изменяется происходит полная компенсация потери энтропии макромолекулы благодаря увеличению энтальпии: т.е. переход макромолекулы из р-ра в поры энергетически безразличен. При >0 и K_d> 1 наблюдается адсорбционная хроматография. В критич. условиях все макромолекулы, независимо от М, имеют K_d= 1 и, не разделяясь, выходят из колонки при V_R = V_Т В эксклюзионной области при макромолекулы с большей М сильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из р-ра в поры уменьшается в большей степени.

На рис. 3 показаны кривые зависимости от энергии взаимод. сегментов макромолекулы (см. Макромолекула) с пов-стью сорбента. Эти кривые для макромолекул с разным числом сегментов (N)пересекаются в точке критич. энергии Кривые левее точки относятся к режиму эксклюзионной хроматографии. Отсюда ясно, что эксклюзионная хроматография включает значит. область энергетич. зависимостей где имеет значения от до Чем меньше тем больше изменение при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

Рис. 3. Зависимость и для разных N(N₁ >N₂>N₃).

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью эксклюзионной хроматографии (когда у всех компонентов , так и в условиях, когда у одного из компонентов В этих (критических) условиях указанный компонент представляет хроматографич. "невидимку" (его K_d не зависит от М). Последнее позволяет по законам эксклюзионной хроматографии анализировать ММР отдельных блоков блок-сополимера, ММР функциональных олигомеров (отдельно для каждого типа функциональности), а вблизи критич. условий получать с помощью эксклюзионной хроматографии. ММР олигомеров для каждого типа функциональности.

У макромолекул, несущих  электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные изменения в зависимости от рН и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении рН выше 4 пов-сть силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим эксклюзионной хроматографии), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.

Для подавления нежелательных  для эксклюзионной хроматографии явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют пов-сть сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу р-рителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. р-рители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их р-ров, то при эксклюзионной хроматографии макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам эксклюзионной хроматографии, а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда пов-сти сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 4. Эксклюзионная хроматография  нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в).

 

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами пов-стью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении эксклюзионной хроматографии.

Техника эксклюзионной хроматографии. Для разделения макромолекул в режиме эксклюзионной хроматографии используют колонки двух типов: работающие в узком = 10²  и широком) = 10₄ — 10⁵ диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности С₂. Можно также составлять колонки для широкого диапазона М из колонок первого типа.

Разные типы полимеров  требуют спец. р-рителей для эксклюзионной хроматографии наиб. универсальный р-ритель - ТГФ (для эксклюзионной хроматографии полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в эксклюзионной хроматографии полимеров. Для эксклюзионной хроматографии полиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов - м-крезол, фторированные спирты и к-ты.

Калибровку колонок в  диапазоне масс 5 х 10²- 1,⁵ х 10⁷ осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистиролов. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата, полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).

Эксклюзионная хроматография  осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр  или проточный рефрактометр с  предельной чувствительностью 5 х 10^-8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10^-5 %. Обычно прибор работает при комнатной т-ре, однако эксклюзионная хроматография полиолефинов требует повышенной т-ры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом М полимера: для полимера с М 10⁴ с = 0,25 % по массе, 3 х 10⁴ - 2 х 10⁴ с = 0,1%, 4 х 10⁵ - 2 х 10⁶ с = 0,05%, М>2 х 10⁶с = 0,01%.

Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света - фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.

Эксклюзионную хроматографию применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М 10² - 2 х 10⁷. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров - выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10-15. Особенность эксклюзионной хроматографии олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна М одного или неск. олигомергомологов.

При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от эксклюзионной хроматографии синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по М при гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т.к. для белков R М^1/3, а для гибкоцепных полимеров R М^1/2. Можно повысить чувствительность определения М белков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М р-ре гуанидинхлорида (R ~ М^1/2) или в р-ре додецилсульфоната Na (R ~ M).

Гель-фильтрацию открыли  в 1959 Д. Порат и П. Флодин, к-рые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.