Свойства ультразвуковых волн, воздействие ультразвука на биосистему

Ереванский  Государственный  Университет

Факультет биологии

Отдел биофизики

 

 

Реферат

Тема: «свойства ультразвуковых волн,воздействие  ультразвука на биосистему »

 

 

Студентка Мелконян Гаянэ

 

 

 

                         

                                         Ереван 2013

 

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ  И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ   ИЗМЕНЕНИЯ Б КЛЕТКАХ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ УЛЬТРАЗВУКА

 

Некоторые виды клеток в обычных условиях существуют в  суспендированном состоянии. Это эритроциты, лейкоциты и другие клетки крови, сперматозоиды, бактерии, одноклеточные водоросли и пр. Другие клетки можно получить в виде суспензии, только применяя специальные методы. Чувствительность разных типов клеток к ультразвуковому воздействию весьма различна. Некоторые из них, например клетки амебы, выдерживают весьма интенсивное облучение. Так, после 10-минутной обработки ультразвуком интенсивностью 200 Вт/см2 (1 МГц) в суспензии остается 50% жизнеспособных особей, а клетки Не La в суспензии начинают разрушаться при 0,7 Вт/см2 (0,75 МГц,).

Одноклеточные, пожалуй, наиболее устойчивы к изменениям внешних условий, к действию различных физико-химических факторов, в том числе к действию ультразвука.

Механическая резистентность одноклеточных заметно меняется в зависимости от их величины, формы, особенностей строения, периода и жизненном цикле и т. д. Однако в среднем она достаточно высока, и многие одноклеточные остаются в суспензии целыми и жизнеспособными даже после облучения весьма интенсивным ультразвуком. Достаточно отметить, что еще никому не удавалось только с помощью ультразвука полностью избавиться от микроорганизмов в жидких средах, т.е. стерилизовать их.

Хорошей моделью  для изучения изменений в клетках  под влиянием ультразвука являются светящиеся бактерии. Их особая ферментативная система преобразует энергию окислительных реакций в электромагнитное излучение видимого диапазона (биолюминесценция), пропорциональное интенсивности метаболизма. Кинетику процессов, происходящих в клетке, можно оценивать на расстоянии по их свечению без вмешательства в жизнедеятельность.В интервале 0,88 МГц биолюминесценция фотобактерий и стимулированная ультразвуком скорость их роста пропорциональны интенсивности ультразвука, но яркость свечения нарастает быстрее, чем количество клеток и единице объема.

Следует отметить, что реакция фотобактерий на ультразвук может заметно меняться в зависимости от их возраста, исходного состояния, наличия в среде тех или иных составляющих и т. д.

Отличия в чувствительности различных клеток к ультразвуковому воздействию связаны с их морфологическими особенностями и функциональным состоянием.

В первую очередь, резистентность клеток к ультразвуку определяется структурой их оболочки, в наибольшей степени подверженной влиянию факторов, действующих в ультразвуковом поле. В непосредственной близости от клеточных мембран как внутри, так и вне клетки, наблюдаются периодические механические воздействия и энергичные акустические микропотоки. Напряжения сдвига под влиянием этих микропотоков могут достигать весьма больших величин (102.103 Н/м2), однако уже 10 Н/м2 (5...60 мин воздействия) оказывается достаточно, чтобы уменьшить время жизни эритроцитов и повысить их чувствительность к осмотическому лизису, увеличить проницаемость цитоплазматических мембран и изменить их поверхностную энзиматическую активность, понизить поверхностный заряд и увеличить скорость оседания эритроцитов в поле гравитационных сил.

Переменные напряжения в акустическом поле, расшатывающие  структуру клеточной мембраны, и  микропотоки, «смывающие» макромолекулы с поверхности клеток, приводят к повышению межфазного натяжения на границе мембрана - среда.

В результате ультразвукового  облучения (0,05 Вт/см2; 0,88 МГц) суспензии  эритроцитов (17000 кл./мм3) в физиологическом растворе в первую же минусу с поверхности каждой клетки десорбируется примерно 2 • 10-14г вещества белковой природы .дальнейшее облучение не приводит к повышению в среде концентрации десорбированного вещества, по-видимому, благодаря достижению равновесия десорбция - резорбция. После прекращения ультразвукового облучения «смытые» макромолекулы быстро сорбируются на поверхности клеток, и через несколько минут идентифицировать белок в среде спектрофотометрически не удастся.

Поверхность клетки покрыта слоем фибриллярного  белка, к которому, как правило, прикрепляются белковые глобулы, мукополисахариды и другие биомакромолекулы. Благодаря белковому покрытию межфазное натяжение между клеточной мембраной и окружающей средой составляет всего 10-3Дж/м2. Белковые молекулы, способные взаимодействовать и с липидами мембран, и с окружающей средой, ведут себя как поверхностно-активные вещества.

Если клеточные  мембраны после ультразвукового  воздействия сохранили свою структурную целостность, то их функциональные характеристики восстанавливаются в течение 10...60 мин. Это восстановление, по-видимому, обеспечивается как функционированием специфических репаративных механизмов, так и процессами резорбции на поверхности мембраны белковых молекул, «смытых» микропотоками. Для заметною снижения межфазного натяжения на поверхности раздела между слоем липидов и белковым раствором должно адсорбироваться довольно много белка, поскольку его поверхностная активность невелика.

Рис.1. Зависимость количества десорбироваиного с поверхности эритроцитов вещества белковой природы

О низкой поверхностной  активности биомакромолекул свидетельствует известный факт: статическое (установившееся) поверхностное натяжение плазмы крови, содержащей 7...8 % белка, на границе с воздухом всего лишь на 20...25 H/м ниже, чем у воды. Время формирования межфазной поверхности может составить десятки минут, так как коэффициент диффузии крупных белковых молекул в водных растворах относительно мал, что существенно ограничивает скорость их сближения с поверхностью.

Если измерить поверхностное  натяжение раствора белка на обновляющейся поверхности, например, в потоке или на поверхности капли, формирующейся на конце пипетки, то значение этого динамического поверхностного натяжения практически не будет отличаться от значений, характерных для поды. Присутствие в среде микропузырьков газа резонансных размеров значительно увеличивает эффективность ультразвукового воздействия на клеточную поверхность.

Значительно слабее действует ультразвук на двухслойные  липидные мембраны, лишенные белкового  покрытия. Долго не удавалось обнаружить изменений в электроемкости, проводимости или разности потенциалов искусственной мембраны, облучаемой ультразвуком с частотой 1 МГц и интенсивностью в интервале 0,1...4 Вт/см2. Более высокие интенсивности ультразвука приводят к фрагментации мембран. Однако ультразвук (0,6 Вт/см2; 0,88 МГц) в определенных условиях значительно - на 60... 100 % - увеличивает электропроводность двухслойных липидных мембран и их проницаемость по отношению к ряду ионов, а также ускоряет встраивание каналообразующего антибиотика нистатина в матрицу мембран, что может быть обусловлено как изменениями механических свойств матрицы, так и нарушениями в прилегающих к пей диффузионных слоях.

Изменения электрофизических  свойств клеточных мембран, вызванные  ультразвуковым воздействием, весьма удобно исследовать, используя одноклеточный организм - ацетабулярию средиземноморскую. Клетки ацетабулярии (рис.2) длиной до 5 см покрыты прочной оболочкой, толщина которой достигает 30 мкм. Более 90 % объема клетки занимает вакуоль. Протоплазма, расположенная между вакуолью и оболочкой, имеет толщину 10...12 мкм.

 

 

Рис.2 Клетка ацетабулярии

Однако ацетабулярии, как и многие другие клетки, способна к иному типу реакции на внешнее воздействие - генерации волны электрического возбуждения (потенциала действия). Отличительной особенностью потенциалов действия ацетабулярии является их большая длительность, достигающая нескольких минут, что существенно облегчает изучение процесса возбуждения. Амплитуда потенциала действия в среднем равна 110 мВ.

Наиболее характерная  реакция клеток на ультразвуковое воздействие (0.2...5 Вт/см2; 0,9 МГц; 5...30 с) - возникновение вызванного потенциала действия. Его появление носит пороговой характер, зависит от интенсивности и длительности ультразвукового облучения (рис. 3 ), а величина на 5...20мВ превышает спонтанный потенциал действия. Типичная кривая изменения мембранного потенциала ацетабулярии приведена па рис. 4 .Потенциал действия не возникает, если первичная деполяризация не достигает некоторой критической величины (15...33 мВ). Исходя из этого, можно объяснить существование порогов ультразвуковых воздействий.

Рис.3 Типичный потенциал действия ацетабулярии в ответ на ультразвук интенсивностью 0,5... 1 Вт/см2 и длительностью 1...5 мин (стрелками указаны моменты включения и выключения ультразвука)

Вследствие деполяризации  мембран под действием ультразвука  пороговой интенсивности достигается  критическая величина деполяризации, после чего генерируется потенциал действия. При интенсивностях выше пороговых потенциал действия возникает через 2…5 с после включения ультразвука. В области интенсивностей ультразвука, близких к пороговым (а также при малой индивидуальной чувствительности клетки), длительность латентного периода может достигать нескольких минут. Ультразвук подпороговых интенсивностей (0,2 Вт/см2) не вызывает возбуждения клеток.

Рис.4 Пороговая кривая, характеризующая зависимость возникновения биоэлектрической реакции клеток ацетабулярии от интенсивности и

Иногда наблюдается  деполяризация на 5... 10 мВ, которая исчезает в течение нескольких минут после выключения ультразвука. Этот факт, а также индивидуальные различия в величине порогов чувствительности к ультразвуковому воздействию свидетельствуют о существовании регуляторных механизмов, способных до известной степени компенсировать изменения в клетке, обусловленные действием внешних факторов.

Визуальные наблюдения за клеткой но время ультразвукового воздействия позволяют обнаружить активизацию движения цитоплазмы. Этот эффект наблюдается и при воздействии другими раздражителями (локальные повышение или понижение температуры, введение микроэлектродов и т. д.) и, по-видимому, является результатом неспецифической реакции клетки на внешнее воздействие.

При относительно высоких  интенсивностях ультразвука (0,6..1 Вт/см2) наблюдается значительная деполяризация клеточных мембран. После выключения ультразвука потенциал через 2...5 мин устанавливается на уровне 90 мВ. Этот уровень регистрируется 25...40 мин, после чего потенциал возвращается к исходным значениям (потенциал покоя), Пo-видимому, ультразвуковое воздействие с интенсивностью, превышающей 0,6 Вт/см2, не только нарушает диффузионное равновесие на мембране, но и ингибирует активный транспорт ионов Сl-. Увеличение интенсивности ультразвука до 1 Вт/см2 (3...5 мин) вызывает структурные нарушения - разрывы и контрактуру цитоплазмы, появление пузырьков, перемешивание клеточного содержимого. Однако пи при этих, ни при более высоких интенсивностях ультразвука (до 2 Вт/см2) не отмечалось разрушения клеток. Высокая механическая прочность ацетабулярии, очевидно, обусловлена большой (до 30 мкм) толщиной ее клеточной стенки.

По-видимому наиболее известное явление, связанное с деполяризацией клеточных мембран, - это изменение их проницаемости. Закономерное увеличение проницаемости под действием ультразвука хорошо проявляется в клетках в суспензии - эритроцитах, лейкоцитах, клетках дрожжей и пр.

Исследования, проведенные  на суспензии эритроцитов в физиологическом растворе, показали, что ультразвук существенно увеличивает скорость диффузии глюкозы и сахарозы в клетки из богатой сахарами среды.

Концентрация углеводов  в среде, содержащей эритроциты, практически не меняется в течение 4 ч при 20 °С. Воздействие ультразвуком (0,1 Вт/см2; 0,9 МГц; 20 мин) приводит к заметному уменьшению концентрации Сахаров в среде. После выключения ультразвука углеводы частично выводятся из эритроцитов (рис.5)

Рис. 5 , Влияние ультразвука (0,1 Вт/см2) на скорость поглощения эритроцитами глюкозы (1,2) и сахарозы (3,4) из раствора: 1/3 - контроль; 2, 4 - опыт (стрелками указаны моменты включения и выключения ультразвука)

Скорость переноса через биологические мембраны относительно крупных молекул практически  не изменяется под действием ультразвука. Так, проницаемость мембран эритроцитов цыплят по отношению к меченому лейцину не испытывает достоверных изменений после 30-минутн от воздействия ультразвуком со средней интенсивностью 0,6 Вт/см2 и частотой 1 МГц, а скорость накопления меченого тимидица в этих же условиях (in vitro) даже несколько уменьшается.

Изменения в свойствах  клеточных мембран, подвергнутых ультразвуковому воздействию, могут быть вызваны переменными усилиями, возникающими в жидкости при распространении ультразвуковой волны. Частицы жидкости в ультразвуковом поле колеблются относительно состояния равновесия с частотой ультразвука. У поверхности благодаря силам сцепления частицы практически неподвижны, однако амплитуда скорости смещения быстро увеличивается по мере удаления от поверхности.

Изменяясь с удвоенной  частотой ультразвука, переменные напряжения сдвига «не успевают» обусловить механических повреждений в клеточной мембране, изменяют, однако, состояние ее поверхности: нарушают двойной электрический слой, смещают глобулы белков, расположенные на поверхности мембран, снижают диффузионные ограничения и т.д. В результате изменяются мембранный потенциал ( потенциал) и проницаемость мембран, возможны также конформационные переходы в мембранных белках, ведущие к изменению их ферментативной активности.

Таким образом, переменные высокочастотные возмущения вблизи мембран могут «детектироваться» клеточной мембраной, обусловливая изменения в свойствах клеток, заметные в течение весьма длительного времени (до десятков минут) после прекращения ультразвукового воздействия.