Специальные методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Метод темного поля

Специальные методы световой микроскопии (освещения и наблюдения).

Метод темного поля.

 Методы микроскопии выбираются  в зависимости от характера  и свойств изучаемых объектов, так как  они, влияют на контрастность изображения.

Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для  получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые  не могут быть видны, если применить  метод светлого поля. Зачастую это  биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат с конденсором специальной конструкции — конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света.

В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов  структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем  преломления. У крупных частиц видны  только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны  частицы или непрозрачны, больший  или меньший показатель преломления  они имеют по сравнению с окружающей средой. При проведении темнопольного исследования предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат).

Метод ультрамикроскопии

В основе метода ультрамикроскопии  лежит тот же принцип – препараты  в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать») чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат  далеко за пределами разрешающей  способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов  удаётся зарегистрировать присутствие  в препарате частиц размером до 2×10^-9 м. Форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном  в коллоидной химии.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными  в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это  могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок  света из конденсора, проходя через  объектив, даёт вблизи фокальной плоскости  окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

 Метод косого освещения - разновидность  предыдущего метода. Отличие между  ними состоит в том, что свет  на объект направляют под большим  углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить  «рельефность» объекта за счёт  образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение  препарата (от осветителя и полупрозрачного  зеркала) производится сверху, через  объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура  препарата видна из-за различия в  отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также  неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод фазового контраста

 Метод фазового контраста — метод предназначеный для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из: набора объективов со специальными фазовым пластинками; конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.Вместо окуляра вставляют вспомогательный телескоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный телескоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого  способа микроскопии контраст живых  неокрашенных микроорганизмов резко  увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

 

Поляризационная микроскопия

 Поляризационная микроскопия  – это метод наблюдения в  поляризованном свете для микроскопического  исследования препаратов, включающих  оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких  элементов). Таковыми являются многие  минералы, некоторые животные и  растительные ткани.  Оптические  свойства анизотропных микрообъектов  различны в различных направлениях  и проявляются по-разному в  зависимости от ориентации этих  объектов относительно направления  наблюдения и плоскости поляризации  света, падающего на них. Наблюдение  можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете.  Свет, излучаемый осветителем, пропускают  через поляризатор. Сообщенная  ему при этом поляризация меняется  при последующем прохождении  света через препарат (или отражении  от него). Эти изменения изучаются  с помощью анализатора и различных  оптических компенсаторов. Анализируя  такие изменения, можно судить  об основных оптических характеристиках  анизотропных микрообъектов: силе  двойного лучепреломления, количестве  оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации,  дихроизме.

Метод интерференционного контраста

 Метод интерференционного контраста  (интерференционная микроскопия)  состоит в том, что каждый  луч раздваивается, входя в  микроскоп. Один из полученных  лучей направляется сквозь наблюдаемую  частицу, другой — мимо неё  по той же или дополнительной  оптической ветви микроскопа. В  окулярной части микроскопа оба  луча вновь соединяются и интерферируют  между собой. Один из лучей,  проходя через объект, запаздывает  по фазе (приобретает разность  хода по сравнению со вторым  лучом). Величина этого запаздывания  измеряется компенсатором. Можно  сказать, что метод интерференционного  контраста сходен с методом  фазового контраста — они оба  основаны на интерференции лучей,  прошедших через микрочастицу  и миновавших её. Как и фазово-контрастная  микроскопия, этот метод дает  возможность наблюдать прозрачные  и бесцветные объекты, но их  изображения могут быть и разноцветными  (интерференционные цвета). Оба метода  пригодны для изучения живых  тканей и клеток и применяются  во многих случаях именно с  этой целью. Главное отличие  интерференционной микроскопии  от метода фазового контраста  – это возможность измерять  разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста  часто применяют совместно с  другими методами микроскопии,  в частности с наблюдением  в поляризованном свете. Его  применение в сочетании с микроскопией  в ультрафиолетовых лучах позволяет,  к примеру, определить содержание  нуклеиновых кислот в общей  сухой массе объекта.

Метод исследования в свете люминесценции

 Метод исследования в свете  люминесценции (люминесцентная микроскопия,  или флуоресцентная микроскопия)  состоит в наблюдении под микроскопом  зелено-оранжевого свечения микрообъектов,  которое возникает при их освещении  сине-фиолетовым светом или не  видимыми глазом ультрафиолетовыми  лучами. В оптическую схему микроскопа  вводятся два светофильтра. Один  из них помещают перед конденсором.  Он пропускает от источника-осветителя  излучение только тех длин  волн, которые возбуждают люминесценцию  либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

ИЗУЧЕНИЕ УСТРОЙСТВА МИКРОСКОПА ИЗМЕРЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ МИКРОСКОПИРУЕМОГО  ОБЪЕКТА.

Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для получения  увеличенных изображений малых  объектов, невидимых невооруженным  глазом. Нормальный глаз человека на расстоянии наилучшего зрения (25 см) может различить мелкую структуру, состоящую из линий или точек при условии, что они находятся друг от друга на расстоянии не меньше 0,07 мм. Размеры же бактерий, органических клеток, мелких кристаллов и т.д. значительно меньше этой величины. Для обнаружения и изучения таких объектов используются типы микроскопов. Оптическая схема микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляр (рис 1). Объектив представляет систему короткофокусных линз, которая предназначена для ослабления сферической и хроматической аберрации. Окуляр микроскопа состоит из нескольких линз. Ход лучей в микроскопе показан на  рис 2. На рисунке 1 изображен общий вид. Его главные части: основание, коробка с микрометрическим механизмом 9, предметный столик 10, револьвер 11 с объективами 5, конденсор 2 и окуляр 7.

Оптическая схема состоит  из 2 частей: осветительной и наблюдательной. В осветительную часть входит: зеркало 1, конденсатор с ирисовой диафрагмой 3 и объемный светофильтр 4. В наблюдательную – объектив, призам 6 и окуляр, соединненые в тубусе микроскопа.

Рассматриваемый объект АВ, помещенный вблизи главного фокуса объектива  образует за объективом действительное, обратное, увеличенное изображение ,  расположенное между фокусом и оптическим центром Ок окуляра. При рассмотрении этого изображения в окуляр, как в лупу, оно будет еще более увеличенным, мнимым и прямым. В конечном счете микроскоп дает изображение А₂В₂, которое является обратным по отношению к предмету АВ. Линейное увеличение микроскопа равно произведению увеличений, даваемых объективом и окуляром:

                                    (1)

Увеличение микроскопа не может быть сколь угодно большим, и его значение не превышает 3000. Это  связано с ограниченной разрешающей  способностью микроскопа, обусловленной  дифракционными явлениями, как изображение  любого предмета есть результат дифракции  и интерференции рассеянного  объектом света. Разрешающей способностью называют свойства оптической системы  давать раздельное изображение двух близко расположенных светящихся или  освещенных точек объекта ( элемента структуры). Разрешающую способность принято измерять величиной :

R = 1/

                           (2)

где - предел разрешения, т.е. наименьшее возможное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

Применяя это понятие  к условиям микроскопирования биологических  объектов, можно считать, что предел разрешения обуславливает наименьшую величину тех структурных деталей, которые могут различаться в  препарате. Как видно из формулы (2), разрешающая способность микроскопа тем больше, чем меньше его предел разрешения.

Теоретически доказано, что  предел разрешения можно определить по формуле (3),

где   - длина волны света, n – показатель преломления среды, между предметом и объективом и объективом, – апертурный угол, т.е. угол, образованный крайними лучами, попадающими в объектив.

Произведение: n – sin ( )  - называют угловой апертурой.

Очевидно, чем выше разрешающая  способность, тем более мелкие детали можно рассмотреть. Повышение разрешающей  способности оптического микроскопа достигается уменьшением длины  волны света, с помощью которого производится исследование, например, путем применения ультрафиолетового  излучения (для этого применяется  специальный микроскоп) и увеличением  числовой апертуры микроскопа. Для  чего необходимо: