Метод цифровой голографической микроскопии

СОДЕРЖАНИЕ

 
 

 

ВВЕДЕНИЕ

Разрешающая способность человеческого глаза  соответствует примерно 100 микрометрам, и для того чтобы человеку увидеть более мелкие предметы, требуются специальные устройства.

В конце XVII века был изобретен микроскоп, который открыл человеку новые миры, и в первую очередь мир живой клетки. К сожалению, у оптического микроскопа есть естественный физический предел разрешения приблизительно равный длине волны света(0,5 мкм), и к концу XIX века этот предел был достигнут. Электронный микроскоп стал следующим этапом позволившим человеку заглянуть вглубь микромира, в роли луча света в таком микроскопе выступает пучок электронов. Благодаря его разрешению, которое достигает несколько ангстрем (0,1 нм), ученым удалось получить изображение вирусов, отдельных молекул и даже атомов. Но и оптический и электронный микроскоп дают лишь плоскую картинку.

Цифровая  голографическая микроскопия дает человеку возможность увидеть трехмерную структуру микромира. Как известно, микроскоп с большим увеличением имеет небольшую глубину поля зрения, поэтому с его помощью можно одновременно наблюдать только небольшие участки сцены, которые находятся в непосредственной близости от фокальной плоскости микроскопа. Для того что бы была возможность наблюдения всей сцены по глубине необходимо производить перефокусировку микроскопа. Что достаточно сложно при условии, если предметом изучения являются движущиеся микрообъекты, например, живые организмы в некотором объеме жидкости. Так как за время перефокусировки микроскопа объекты могут перемещаться в пределах сцены, что может дать искаженное представление об изучаемых микрообъектах и их количестве. Техника голографической микроскопии позволяет преодолеть эту трудность. Для этого необходимо через объектив микроскопа, имеющий большую глубину резкости, чем весь микроскоп в целом, и с помощью импульсного источника излучения либо с помощью скоростной кинокамеры при непрерывной излучении произвести голографирование изучаемой области. Полученное в результате объемное изображение следует рассматривать через окуляр микроскопа, который можно фокусировать на различные плоскости полученной объемной картины.

В настоящее время существует множество экспериментальных данных, касающихся возможностей практического применения голографической микроскопии в самых различных областях науки и техники.[1] 

1. ГОЛОГРАФИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ.

1. Общие сведения о голографической микроскопии.

Современный, неинвазивный метод для изучения микрообъектов и процессов микроуровня, в том числе и динамических.

Метод чувствителен к изменениям оптического пути, который варьируется при незначительных изменениях коэффициента преломления и формы образца, поэтому для наблюдения прозрачных и полупрозрачных образцов не требуется применять какие-либо методы увеличения контраста. Кроме того, интенсивность света, применяемого при цифровой голографической микроскопии, в несколько тысяч раз меньше, чем применяемого в конфокальной микроскопии. [2] 

2. Достоинства цифровой голографической микроскопии.

1. Большая глубина резкости в двадцать и более раз превышающая значения характерные для обычного микроскопа, позволяет наблюдать одновременно несколько объектов, находящихся на разном фокусном расстоянии, за счет возможности реконструкции произвольного сечения объема. 
2. Непосредственный доступ к информации об амплитуде и фазе волнового фронта дает широкие возможности для фильтрации и автоматического анализа объектов (их положения в трехмерном пространстве, размеров, формы). 
3. Метод является неразрушающим: не требуется никакой предварительной подготовки образцов, никакого окрашивания. [2]

 

3.  Применение и области применения методов цифровой голографии.

Области применения методов цифровой голографии:

1. Медицина, биология, экология, океанология.
2. Микроэлектроника, микроэлектромеханические (MEMS) и микрооптоэлектромеханические (MOEMS) системы, нанотехнологии.

 

Применение методов цифровой голографии:

1. Измерение трехкомпонентных скоростей нестационарных пот оков и микропотоков в трехмерном пространстве (D-HPIV). 
2. Отслеживание траектории движения частиц в трехмерном пространстве и изучение процессов агломерации частиц. 
3. Измерение распределения по размерам аэрозольных частиц, пыли или частиц суспензии (особенно актуально, если частицы имеют форму отличную от сферической, когда непосредственное применение теории Ми некорректно). 
4. Бесконтактный контроль топологии и шероховатости поверхности с точностью до нескольких нанометров (в системах контроля качества). 
5. Измерение малых деформаций и перемещений вплоть до нескольких нанометров. 
6. Исследование физики микрокапель (droplets). 
7. Неинвазивный метод для изучения динамических процессов в живых клетках. В том числе при исследованиях раковых клеток и клеток крови. 
8. Изучение планктонных организмов, динамики поведения и способов их передвижения (океанология, биология, экология). [2]

 

2. ОБЗОР МЕТОДОВ ДЛЯ  ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ  КЛЕТКАХ.

1. Конфокальная микроскопия:

Современный метод регистрации флуоресцентных микрообъектов, с использованием оптического микроскопа, диафрагма которого, обеспечивает регистрацию флуоресценции только от объектов, расположенных в фокальной плоскости.  

Принцип действия: 

Луч лазера с помощью селективного зеркала направляется в объектив микроскопа и фокусируется на точке в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, излучаемая из этой точки, собирается объективом и фокусируется линзой в сопряженной фокальной плоскости объектива, проходя через отверстие в  

Рисунок 1. Схема конфокального микроскопа. 

конфокальной диафрагме к фотоэлектронному умножителю. Флуоресценция, излучаемая из других точек объекта, дефокусирована на конфокальной диафрагме и к фотоэлектронному умножителю не проникает. Тем самым обеспечивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива, и улучшается разрешение вдоль оптической оси объектива. Информация об объекте по каждой линии сканирования передается в компьютер, где с помощью программы реконструируются объёмные изображения объектов. [3]

  
 
 

«+»

• Высокое разрешение вдоль оптической оси объектива и в плоскости объекта, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации отраженных от образца лучей.
• Высокая контрастность изображения.
• Возможность проведения объемной реконструкции объекта и получение его трехмерного изображения.
• Исследования  динамических процессов, происходящих в живых клетках, возможны при помощи записи серии оптических срезов, из которых можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение. [4]

«-»

• В конфокальном микроскопе существуют случайные флуктуации сигнала или шумы, имеющие разнообразную физическую природу. Высокочастотные шумы проявляются на изображении как яркие или темные точки,  и их источниками являются лазеры,  фотоприемники,  электронные блоки, волоконно-оптические кабели. Низкочастотные шумы видны как горизонтальные полосы.  Эти шумы могут возникать из-за наводок по электрической сети,  вибраций и других причин. 
• При попытке повышения яркости изображения, при помощи увеличении мощности лазера, может произойти  «выцветание»  препарата,  а также повреждение живых клеток.
• Большое время получения объемного изображения – от десятков минут до нескольких часов. [5,6]

 

2. Ультрафиолетовая микроскопия:

Разновидность световой микроскопии.

Метод основан на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов и тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волны. В ультрафиолетовом микроскопе используют короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах. [7] 

 Принцип действия:

Живая клетка освещается ультрафиолетовыми  лучами, некоторые вещества (нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты и т.д.), входящие в состав клетки поглощают ультрафиолетовое излучение. В результате получается в ультрафиолетовых

Рисунок 2. Схема ультрафиолетового микроскопа.

лучах невидимое глазом изображение, которое преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств таких как люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь. Изображение представляет собой свечение вызванное только тем ультрафиолетовым светом, которое осталось не поглощенным при прохождении через живую клетку. 

Метод используется для исследования живых объектов и их изменений в процессе жизнедеятельности. 
 
 

«+»

• Позволяет увеличить предельную разрешающую способность (порядка 0,1 мкм).
• Частицы прозрачные в видимом свете, хорошо поглощают ультрафиолетовое излучение определенных длин волн, и, следовательно, хорошо различимы на ультрафиолетовых изображениях.

 

«-»

• Не цветное изображение или изображение в условных цветах (препарат фотографируется в трех   длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определенного цвета (например, синим, зеленым и красным), и все они одновременно проецируются на один экран. В результате на экране создается цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете).
• Необходимость применения дорогих кварцевых линз вследствие интенсивного поглощения ультрафиолетового излучения стеклом.
• Необходимость применения для фокусировки флуоресцентного окуляра и пластинки покрытой флуоресцентными кристаллами. [8,9]

3. Фазово-контрастная  микроскопия:

Передовой метод диагностики живой клетки. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления. [7]

Фазово-контрастная микроскопия находит применение в микробиологии, паразитологии, при исследовании микроорганизмов, простейших клеток растений и животных, при изучении клеток культуры тканей. 

Рисунок 3. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Принцип действия:

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется фаза колебания световой волны. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. При помощи фазово-контрастного конденсора и фазового объектива часть света, проходящего через микроскоп, сдвигается по фазе на половину длины волны относительно другой части, благодаря чему

достигается контраст на изображении. 
 

«+»

• Неинвазивный метод.
• Позволяет получить контрастное изображение прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при использовании обычных методов микроскопии.
• Возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.
• Возможность применения метода на обычном микроскопе, путем использования специальных компонент (окуляры, конденсор). Примерная стоимость компонент 32 000 рублей. [10]

 

«-»

• Наличие светящихся ореолов вокруг объектов.
• Не увеличивает разрешающей способности микроскопа.
• Позволяет наблюдать только контуры объектов. [11,12]