Cаңырауқұлақтарды микробиологиялық түрде зерттеу әдістері

  САҢЫРАУҚҰЛАҚТАРДЫ МИКРОБИОЛОГИЯЛЫҚ  ТҮРДЕ ЗЕРТТЕУ ӘДІСТЕРІ

Саңырауқұлақтардың микроскопиялық құрылысын зерттеу үшін сүрленген  не тірі материалдарды пайдаланады. Өсімдік тканындағы саңырауқұлақ гифтері  айқын көру үшін 0,5-1% (метилен көк) бояғыш заттарды пайдаланған жөн. Микроскопты  пайдаланып спорадан саңырауқүлақ мицелийінің  өсуін 48-76 сағат уақыт арасында толық  жетіліп дамуын байқауға болады. Биологиялық микроскоп арқылы ядро санын және басқа органоидтарын зерттеуге болады.                

Мицелийден волютинді анықтау үшін 96% 100 мл спиртке 3 г метилен көк бояуын салып, араластырады да бірнеше күнге қалдырады. Қолданардың алдында оны сүзеді де 5-10 есеге дейін езеді. Не болмаса 100 мл тазартылған суға 30 мл қанған спирттегі бояуды және Імл 1% күйдіргіш калии ерітінділерін қосады. Бүл ерітіндіні көп уақыт бойы сақтауга болады. Клетка қабықшасын таннин ерітіндісімен бояйды. Бүл бояуды барлық саңырауқүлақ клетка қабықшаларын көру үшін пайдалануға болады. Дайындалған препоратты спиртовка жалынына ұстап, оған 20% таннинның судағы ерітіндісін тамызады. Бояу уақыты 20-30 минут. Ашытқы саңырауқүла-ғының қабықшасын байқау үшін Карнуа сұйығына сүрлегеннен кейін оны 2-5 минут 10% танниннің судағы ерітіндісіне салады. Одан кейін жақсылап жуады да Пфейфера фуксинімен бояйды да микроскоппен қарағанда қабықша көкшіл түске боялады. Бүдан басқа дайындалған препаратты 0,5% генциавиолета бояуына 2-3 минуттай ұстағаннан кейін жуады да 0,5% конго-қызыл бояуының судағы ерітіңдісіне 2-3 минут ұстағаннан кейін жуып кептіреді. Кабықша күңгірт көк не қара түске боялады.                

Целлюлозаны бояу үшін Швейцер реактивін пайдаланады. Ол үшін 20г хлорцинкиодты 6,5г калий иод ерітіндісіне ерітіп, оған 1,3г қатты иодты қосады, суды Юмл-ге дейін жеткізеді. Ерітіндіні қараңғы жерде сақтау қажет. Целлюлоза көкшіл күлгін түске боялады. Пектин затын анықтау үшін бір сағат бойы қаныққан сілтіде қайнатады да сумен жуып күкірт қышқылында бейтараптандырады. Содан соң бір-екі тамшы иод және бірнеше тамшы ерітілген күкірт қышқылын тамызады. Сол уақытта пектин заты ашық күлтін түске боялады.                

Ядро аппаратын бояу үшін препаратты Карнуа сұйығында 10-30 минуттай ұстап, 80% спиртпен жуады. Реакция тек гидролизденген материалда ғана жүреді. Ол үшін препаратты 2-3 мин 1н түз қышқылының үй темпера-турасындағы ерітіндісінде ұстайды. Одан кейін 5-6 мин 1н тұз қышқылының 60°С-қа дейін қыздырған ерітіндісінде ұстайды. Бүдан соң қайтадан алғашқы ерітіндіге 2-3 мин ұстағаннан қейін 2-3 сағат Шиффа реактивне салады. Ол реактивті дайындау үшін 0,5 г. фуксинді 90 мл таза қайнап тұрған тұзға ерітіп, ерітіндіні 50° С-қа төмендетіп сүзеді де, оған 2 мл концентрациялы түз қышқылын қосады. 10мл суық суға жеке 2 г. сусыз не 4 г. кристалды натрий сульфатын дайындайды. Дайындалған ерітіндіні фуксин ерітіндісіне қосып 25°С-қа дейін суытады. Реактивті шыны тығыны бар ыдысқа құйып суық жерге сақтайды.Ерітіндінің түсі сұйық шайдың тусіндей болуы қажет.                

Ядроны Делафильд әдісі бойынша гематоксилинмен бояу үшін материалды 35-50% спиртте фисациялағаннан кейін бояғышқа салады. Ол үшін 1 г. гематоксилинді 6 мл абсалютті спиртке ерітеді. Бүл ерітіндіге 100 мл аммоний ашудясынын судағы қаныққан ерітіндісін тамшылап қосады да бір жетіден кейін 25мл глицерин мен метил спиртін қосып 4 сағаттан кейін сүзеді. Боялу уақыты 3-30 мин. Содан соң 5-30 минуттай уақыт бойы суда жуады. Алынған затты бір-бірінен ажырату үшін суға не спиртке тұз қышқылын қосады (бір тамшы тұз қышқылына 100 мл су қосады). Бұдан соң 70% спиртпен және сумен жуады. Сол уақытта ядро қызыл түске, клечатка күлгін түске боялады. Ядроны гематоксилин жөне эозинмен (эритрозинмен), клечатканы Делафильд гематоксилинмен де бояйды. Дифференциациялау үшін қышқылданған спирттен өткізеді және кесінділерді эозиннің 1% спирттік ерітіндісіне 1-2 мин. батырады. Содан соң күшті спирт арқылы өткізеді де жуады. Ұнда ядро мен клечатка қарақошқыл, ал протоплазма алқызыл түске боялады

Зерттеу үшін әдетте жаншылған  тамшы әдісін қолданады. Жақсылап жуылған  және құрғатылған зерттеу шынысының үстіне сүзілген суды құяды және  зерттеліп отырған материалымызды  орналастырады. Препаратты жабынды шынымен жабады, содан соң  оның өсуін байқаймыз. Гифті саңырауқұлақтар үшін (асперилді және пенициллі) конидиялық аппаратты құру үшін арнайы өңдеу жүргізу қажет. Петри табақшасына  ортаға сәйкес  саңырауқұлақтардың колониясының алдын-ала өсірілген түрін салады да, содан соң  70⁰С этанолдың бірнеше тамшысымен колонияны өңдейді, содан соң сумен шайып тастаймыз. Мұнда артық конидияларды салып тастауды, гифтердің өткірлігінің жоғарлағанын байқаймыз. Бұдан кейін колонияны  жабынды шынымен, микроскоп көмегімен зерттеуге  мүмкіндік туады. Егер спорангиялардың, қалталардың т.б.  қабаттары дұрыс саңырауқұлақтар зерттелетін болса, онда препаратты суда емес, спирт қоспасында , глицерин мен су қоспасында (1:1:1) дайындаған жөн.

Конидиі және  спорасының  және де басқа элементтердің  сыртқы  қабатының ескіруіне бақылау кезінде  өркен саңырауқұлақтарын байқайтын болсақ, онда  мацераций тәсілін қолданамыз. Бұл тәсіл бойынша зерттеліп отырған материалды  улы калий ерітіндісін зерттеу  шынысына  орналастырып, оны 90⁰С қайнағанша қыздырамыз, содан соң  суығанынша жабынды шынымен жабамыз. Суығаннан соң препаратты микроскоптың көмегімен көреміз. Саңырауқұлақтардың  өсу түрін, әртүрлі физиологиялық заңдылықтарын түсіну сияқты терең зерттеу жүргізгенде  арнайы – Раньве камерасында, Ван Тигема сақинашықтарында жүргізеді. 

Раньве камерасы – тегіс  сфералық тереңдетілген зерттеу  шынысы, оның түбіне зерттейтін сұйықтықты, көбіне суды  немесе Чапек ортасын орналастырады, содан соң термостатқа енгізеді. Біраз уақыттан кейін препаратта микроскоптың көмегімен зерттейді. Кейде сфералық түбі сәуленің жүруін ауыстырып жіберуі мүмкін, онда Ван Тигема  сақинашықтарын пайдалану қолданған жөн. Бұл диаметрі 1,5см, қалыңдығы-1,5-2 мм шыны трубкасымен жасалған цилиндриктер. Олар  бөлек стерильденеді, содан соң зерттеу шынысын пластелиннің көмегімен қысып, ортаны енгізгеннен кейін зерттеу шынысын оның жоғарғы жағынан қыстырады. Бұл кезде сақина типті 2мм-ден аспау керек.

Обьектінің морфологиялық  өзгеруін анықтауда тек сұйық  ортаны ғана пайдаланып қана қоймай, агаризді ортаны да пайдалануға болады, ал оның ұшып кетпеуін қамтамасыз етеді. Ол үшін Н.Пидопличенко (Пидолличенко, 1953) тәсілі бойынша саңырауқұлақтарды зерттеу  шыныларында жүргізеді. Зерттеу  шыныларын хромды қоспада  жақсылап жуып тастап, кептіреді, содан соң оларды топ-топқа орналастырып, орап, автоклавта стерилдеп болған соң, ақырындап бір-бір шыныдан шығарады, содан соң газды қыздырғышта немесе  спиртовкада  тағы да қыздырамыз.

Қыздырған  шынының бір бетіне  ерітілген агаризді ортаны орналастырады. Оны біраз суытып алып, қыздырғыш қасында зерттеліп отырған материалымызды иненің  көмегімен тамшы ортасына  тамызамыз. Содан соң алдын-ала дайындалған зерттеу  шынысын қыздырғыш үстінде қыздырып, суыған соң сұйықтың үстіне орналастырады (Литвинов,1969).

Препараттарды сүзілген судан  гөрі 1%-ті сулы немесе сулы спирттің метиленді  көгінде, сүт қышқылын немесе глицерин-су қоспасында(1:1) дайындаған жөн. Бояу үшін – генцианвиолет метиленблау, сафранин, неитральрот, эритрозин (бірақ оның концентрациясы 1:1000 немесе 1:10000 болуы  керек) бояулар қолданады.

Тұрақты  препаратты дайындау үшін Аммана лактафенолын (сүт қышқылы, фенол, глицерин сүзілген су 1:2:1) немесе глицерин  - желатинін (желатин, глицерин, су – 1:7:6, 0,5-1) тимол немесе фенол қосу нәтижесінде қолданады.

Саңырауқұлақтардың таза түрлерін ажыратуда оларға әркез  бактериялар ілеседі. Оларды жою  үшін 3,8-3,6 pH қышқылдық орта немесе  оларға антибиотиктер: пенициллин 30-40    1мл ортада, тетрациклин, окситетрациклин, хлоротетрациклин – 2-5 мг/л, ал неомицин, полимиксин және бацитрацин – 50 мг/л концентрациясын қолданады. Антибиотиктерді қосу стерильді түрде жүруі керек. Оларды стерилиздеуден кейін және суығаннан кейін қосады.

Моноспора аскоспоралы саңырауқұлақтарын  бөліп алу үшін келесі құрадымды  пайдаланамыз(г): KH₂SO₄ – 1.25,  MgSO₄ ∙ 7H₂О – 0,625, Co(NO₃)₂ – 1, мальтоза – 20, агар – 20, сүзілген су – 1л-ге дейін. Алкалоидтарды алу үшін күрделі құрылысты бөліп алу пайдаланылады. Мұнда сұйық орта  пайдаланылады (г/л): сорбитол – 50, сукцинді қышқыл – 36, K₂HPO₄ – 2, FeSO₄ ∙ 7H₂О – 0,001,  рH – 6 (NH₄OH қосу арқылы). Өсіру Эрленмеир колбаларында 24±1⁰С температурада жүзеге асады. Ең тиімді тәсіл 4,5% мальц-экстракт қосылған 5 күндік инокуль қосқан жөн.

Зақымдалған және зақымдалмаған  өсімдіктерден алынған Cl.purpurea пішімдерін алкалоидты биосинтез процестері кезінде  бірнеше ферментация ерекшеліктерін ескерген жөн.

Алкалоидтарды үлкен көлемде  алу үшін: жоғары осматикалық қысымы бар ортада бөліп алу, ортаны дұрыс  таңдау, мицелийдің дифференцияциясының  дәрежесі төмен дәрежеде болуын қадағалау, ақуыздың жаңаруы мен алуалоидтардың түзілуінің арасындағы байланысты байқау, Кребс және глиоксалатты циклінің активтілігін төмендету, майлы қышқылдардың түзілуі  және ацетил-КоА алынған алкалоидтар  биосинтезі арасындағы процесстердің  интенсивті бейімділігін қамтамасыз ету, ферментация кезінде алкалоидтардың құрамын бақылау керек. Клеткада пайда болған алкалоидтарды байқау барысында протопластың 2 тобы –  вакуольды емес (20%) және вакуольды (80%) анықталған.

Бұрыннан-ақ кордицепстерді бөліп алу және зерттеу жұмыстары  жүргізілген болатын. Cordyceps norvegica Olsen Sopp (Seaver, 1911) телеморфы алынған. Қоректендіруші орта ретінде агар және желатин қосылған мальц-экстракт қолданған. Мұнда біраз  уақыттан кейін стромалар байқалған.