Введение генов в клетки растений. Достижения генной инженерии. Проблемы биобезопасности трансгенных растений

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Тюменский Государственный Университет

Институт биологии

Кафедра анатомии и физиологии человека и животных

 

Введение генов в клетки растений. Достижения генной инженерии. Проблемы биобезопасности трансгенных растений.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнили:

Зорков Василий Александрович

Чудаев Александр Валерьевич

 

 

 

г.Тюмень, 2014 год

Содержание

Введение..................................................................................................................1

Метод биологической баллистики (биолистики)............................................5

Электропорация.....................................................................................................6

Улучшение качества запасных белков...........................................................11

Жиры......................................................................................................................13

Полисахариды......................................................................................................14

Создание гербицидоустойчивых растений ....................................................14

Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям....................20

Повышение эффективности биологической азотфиксации.......................21

Повышение эффективности фотосинтеза.......................................................23

Получение растений с новыми свойствами...................................................24

Проблемы биобезопасности трансгенных растений.....................................25

Список литературы............................................................................................30

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых ( рекальцитрантных ) к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

Разработаны два метода для введения Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, в растение.

Первый метод — метод «промежуточных векторов» (коинтегративных векторов) — основан на использовании плазмиды кишечной палочки pBR 322.

Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в кишечной палочке. Затем с помощью конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду.

Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

Второй метод основан на создании системы бинарных (двойных) векторов.

Последние исследования показали, что для заражения и трансформации не нужна целая Ti-плазмида, а достаточны только пограничные области Т-ДНК и один участок Ti-плазмиды, ответственный за вирулентность. Причем эти два участка ДНК не обязательно должны находиться в одной и той же плазмиде. Если клетки агробактерий содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. При этом Т-ДНК с любыми встроенными в нее генами интегрирует с геномом растения, для этого не нужна гомологичная рекомбинация в бактериальных клетках. Для осуществления экспрессии чужеродных генов, нужен специфический промотор из Т-ДНК, например, промотор нопалинсинтетазы.

Показано, что он функционирует в клетках растений и может быть легко соединен с кодирующей последовательностью чужеродного гена в широко распространенных субклонах Ti-плазмид. Другое преимущество данного промотора заключается в том, что он функционирует в каллусах и в большинстве органов растений. Эффективность трансформации с помощью модифицированной Т-ДНК агробактерий превосходит на сегодняшний день все другие способы переноса генов в растение.

О механизмах, с помощью которых агробактерия переносит Т-ДНК ядра растений, известно очень мало: Т-сегменты ДНК октопиновых и нопалиновых плазмид встраиваются в разные, по-видимому случайные, точки хромосом хозяина, но при этом они никогда не интегрируют с ДНК митохондрий и хлоропластов.

Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные (пораненные) области растения.

Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями. Методика кокультивации может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. Если агробактерии добавляются к свежевыделенным или однодневным протопластам, не наблюдается ни присоединения бактерий, ни трансформации. Существенным условием для трансформации является наличие вновь образуемых клеточных стенок у 3-дневных протопластов. Это подтверждается применением ингибиторов образования клеточной стенки, которые ингибируют и присоединение бактерий. После периода кокультивации (более суток), в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3—4 недели небольшие колонии высеваются на без гормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток.

Так были получены трансформированные растения - регенераты табака и петунии. Этот метод дает возможность существенно расширить круг хозяев агробактерий, включая виды семейства злаковых. Эффективность кокультивирования может быть повышена применением индукторов слияния клеток (ПЭГ, кальций и др.).

Трансформация протопластов может быть проведена также кокультивированием их непосредственно с Ti-плазмидами, такие опыты были проведены с протопластами петунии, табака. Очень низкая эффективность включения Т-ДНК в протопласты, наблюдавшаяся в первых экспериментах, была затем увеличена благодаря химической стимуляции (ПЭГ). Из трансформированных клеток были получены трансгенные растения. Преимуществом этого метода является то, что отпадает необходимость в промежуточных векторах.

Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно однодольных.

Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты. Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, биолистическая трансформация применяется для прямого переноса ДНК в эмбриогенную пыльцу и дальнейшего быстрого получения трансгенных дигаплоидных растений, которые являются важным этапом в селекционной работе. В настоящее время этим методом была проведена трансформация растений табака и после регенерации гаплоидных растений получены стабильные трансформанты.

Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют клетки и фрагменты ДНК, которые необходимо ввести в клетки (рис. 46). Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается.

Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Электропорация — физический, а не биохимический метод, и это, по-видимому, обусловливает его широкое применение. Многочисленные исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно использоваться для введения молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируемые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2 кВ/см.

Электропорация — наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки. Однако до недавнего времени этот метод использовался в ограниченном числе лабораторий в связи с отсутствием серийных приборов — электропораторов. Появление и совершенствование таких приборов в ближайшие годы приведет к широкому применению данного подхода в генетической инженерии самых разных типов клеток.

Cлияние двух типов протопластов происходит при их смешивании в присутствии полиэтиленгликоля. Смесь наносят на стекло и через 15 мин отбирают продукты слияния. Затем их культивируют на питательной среде, в результате чего происходит регенерация клеточной стенки и образуется гибридная клетка , а затем соматический гибрид.

Известно, что при смешивании клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое. Эффективность слияния может быть существенно увеличена с помощью     специфических антигенов. Первоначально для этой цели использовали инактивированный вирус Сендай, однако биологическая неоднородность различных партий инактивированного вируса и громоздкость процедуры слияния, индуцированного вирусом, привели к широкому использованию химического индуктора —полиэтиленгликоля (ПЭГ). Метод, представленный ниже, пригоден для слияния клеток как одного, так и разных видов животных. Внутривидовые гибриды формируются с частотой 10- —10- . Частота слияния клеток разных видов варьирует от 10 до 10 Клетки, имеющие сходные фенотипы и близкие параметры роста, сливаются с более высокой  частотой.

В результате     слияния протопластов получение растений-регенерантов. При помощи ферментативного гидролиза разрушаются клеточные стенки и образуются раздетые клетки, или протопласты. Они способны к слиянию, и этот процесс называется парасексуальной гибридизацией растительных клеток. Индуктором слиянияявляется полиэтиленгликоль, а образованные гибридыобрабатываются сильным щелочным раствором или диметилсульфоксидом. Техника слияния напоминает образование гибридов животными клетками, однако имеется существенное отличие. Слияние животных клеток позволяет получить только лишь новую клетку, а слияние протопластов является основой получения новогогибридного растения. Парасексуальная гибридизация посредством слияния протопластов дает возможность скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, а также комбинировать родительские гены растений  в различных вариантах.

Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в    достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать.  Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом , миеломные клетки.