Вращающиеся моторы живой клетки

Министерство  образования и науки Российской Федерация

Федеральное государственное бюджетное образовательное  учреждение  высшего профессионального  образования

«Пермский государственный  гуманитарно-педагогический университет»

 

 

 

 

Реферат по дисциплине молекулярная биология:

«Вращающиеся моторы живой клетки»

 

 

 

Работу выполнила:

Студентка 641 группы

Естественнонаучного факультета

 Булдакова  Алёна Александровна 

Проверил:

Петрухин Алексей Юрьевич

 

 

 

 

 

 

2013 год

 

Молекулярные  моторы 
Часть 1. Вращающиеся моторы живой клетки 
А. Н. ТИХОНОВ 
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

«Все ферменты красивы, но АТРсинтаза является одним из самых красивых, а также самых необычных и важных.» 

ВВЕДЕНИЕ 
Эпиграфом к статье взяты слова Поля Бойера, выдающегося американского биохимика, внесшего решающий вклад в выяснение ферментативных механизмов образования аденозинтрифосфата (АТР) из аденозиндифосфата (ADP) и неорганического фосфата. Молекула АТР является универсальным источником энергии для большинства многочисленных биохимических, механохимических и транспортных процессов, которые протекают внутри живой клетки. Неудивительно поэтому, что АТРсинтаза - основной фермент, катализирующий образование АТР, - назван П. Бойером одним из самых важных ферментов. В чем заключаются красота и необычность этого фермента? АТРсинтаза представляет собой великолепную молекулярную машину, доведенную природой до высшей степени совершенства. Подобно тому как в каждой совершенной машине наивысшие технические показатели сочетаются с ее изящными формами, в АТРсинтазе - молекулярной машине живой клетки - высочайшая эффективность работы сочетается с поразительной красотой ее структурной организации. Необычность АТРсинтазы состоит в том, что она работает как вращающаяся машина, подобно электромотору, крутящемуся при пропускании электрического тока через его обмотку. Однако в отличие от электромоторов, используемых в технике, ротор АТРсинтазы приводится во вращение при прохождении через нее электрического тока, создаваемого не движением электронов, а потоком протонов. 
Бактерии плавают за счет вращения жгутиков, которые приводятся в движение так называемым флагеллярным мотором (от лат. flagellum - жгутик). До недавнего времени считалось, что флагеллярные моторы являются самыми миниатюрными вращающимися моторами [1, 2]. Однако в последнее время было доказано, что самым маленьким из всех известных в природе вращающихся моторов является протонная АТРсинтаза. Несмотря на различие в строении и назначении протонных АТРсинтаз и флагеллярных моторов (первые совершают химическую, а вторые выполняют механическую работу), они имеют два общих свойства. Эти моторы содержат вращающиеся детали, а в качестве топлива используют энергию, запасаемую в виде разности электрохимических потенциалов ионов водорода на мембране [1-4].

АТРсинтаза - САМЫЙ МАЛЕНЬКИЙ МОТОР В ПРИРОДЕ

 

 

 

Протонные АТРсинтазы (общая характеристика) 
АТРсинтаза является макромолекулярным комплексом, катализирующим синтез и гидролиз молекул АТР в энергопреобразующих мембранах клеток растений, животных и бактерий [1-4]. Расположение ATPсинтазы в мембранах хлоропластов и митохондрий схематически показано на рис. 1. Мембранная часть АТРсинтазы, называемая фактором сопряжения F₀ , представляет собой гидрофобный (нерастворимый в воде) белковый комплекс. Второй крупный фрагмент ATPсинтазы - фактор сопряжения F₁ - заметно выступает из мембраны в виде сферического образования. В хлоропластах - энергопреобразующих органеллах растительной клетки - АТРсинтаза встроена в мембраны тилакоидов (на рис. 1 они схематически изображены в виде замкнутых пузырьков), при этом фактор сопряжения F₁ ориентирован во внешнюю сторону. В митохондриях - энергетических "фабриках" животной клетки - АТРсинтаза встроена во внутреннюю мембрану, а комплекс F₁ обращен в сторонуматрикса (внутренняя часть митохондрии). Образование АТР из ADP и неорганического фосфата (Pi) происходит в каталитических центрах АТРсинтазы, расположенных в комплексе F₁ [3]. Белковый комплекс F₁ можно сравнительно легко отделить от мембраны, при этом он сохраняет способность катализировать гидролиз ATP. Однако изолированный фактор сопряжения F₁ не способен синтезировать ATP. Способность синтезировать ATP - это свойство единого комплекса F₀F₁ , встроенного в энергопреобразующую мембрану. Связано это с тем, что работа АТРсинтазы в режиме синтеза АТР сопряжена с переносом через нее протонов, путь которых пролегает через F₀ и направлен в сторону F₁ (рис. 1, а). Такой направленный перенос протонов возможен только в том случае, если АТРсинтаза встроена в мембрану замкнутых энергопреобразующих органелл (хлоропласты и митохондрии) или в плазматическую мембрану бактериальной клетки. 

 

Рис. 1. Расположение протонных  АТРсинтаз в мембранах хлоропластов и митохондрий. Голубые участки соответствуют областям с повышенным протонным потенциалом (кислотные резервуары), Участки песочного цвета - области с пониженным протонным потенциалом (щелочные резервуары). Внизу показано направление переноса ионов водорода через мембрану в режимах синтеза (а) и гидролиза (б ) молекул АТР

Движущей силой для  работы большинства АТРсинтаз является протонный потенциал, создаваемый на мембране в результате работы цепи электронного транспорта [1-4]. Реакции фотосинтетического переноса электронов в хлоропластах сопровождаются транспортом протонов внутрь тилакоидов, в результате чего концентрация ионов водорода внутри тилакоидов становится существенно выше, чем снаружи. В митохондриях работа дыхательной цепи сопровождается переносом ионов водорода в противоположном направлении: протоны выходят из матрикса наружу, в результате этого электрический потенциал со стороны матрикса понижается. За счет разности протонных потенциалов по обе стороны мембраны возникает поток ионов водорода через АТРсинтазу (рис. 1, а), который и обеспечивает ее работу по синтезу АТР. В хлоропластах синтез АТР сопряжен с переносом ионов водорода из кислотного внутритилакоидного объема в щелочной внешний объем (в строму - пространство между тилакоидами и оболочкой хлоропласта); в митохондриях работа АТРсинтазы связана с потоком протонов, направленным внутрь матрикса (рис. 1). Протонпроводящий канал, по которому ионы водорода из области с высоким протонным потенциалом подводятся к определенным функциональным группам АТРсинтазы, а затем выходят в область с низким протонным потенциалом, расположен в мембранном фрагменте АТРсинтазы (комплекс F₀). 
АТРсинтаза - это обратимая молекулярная машина, которая способна катализировать как синтез, так и гидролиз АТР. В режиме синтеза АТР работа АТРсинтазы обеспечивается за счет энергии ионов водорода, переносимых через нее под действием трансмембранной разности протонных потенциалов (рис. 1, а).

Рис. 2. Схема строения АТРсинтазы. Комплексы F1 и F0 всех изученных протонных АТРсинтаз бактерий, цианобактерий и хлоропластов высших растений имеют одинаковый состав белковых субъединиц ( )3  и abc9-12 соответственно. У АТРсинтазы митохондрий животных мембранный комплекс F0 наряду субъединицами a, b и c содержит шесть дополнительных белковых субъединиц (d, e, f, g, F6 и А6L), а F1 дополнительно включает в себя два небольших белка (OSCP и специальный регуляторный белок-ингибитор). Внизу показан контурный профиль F0F1 комплекса, в котором синим цветом выделены субъединицы статора, а красным цветом - субъединицы ротора

В то же время АТРсинтаза может работать как протонная помпа - за счет энергии, выделяющейся при гидролизе АТР, она может перекачивать ионы водорода в противоположном направлении, из области с низким протонным потенциалом в область с высоким протонным потенциалом (рис. 1, б ).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Строение АТРсинтазы 
Состав и пространственное строение комплекса F₁ хорошо изучены. Методом рентгеноструктурного анализа получена картина пространственного расположения атомов (с разрешением 2,8 Б) в комплексе F₁ , выделенном из митохондрий сердца быка. Ориентированный в водную фазу комплекс F₁ (рис. 2) состоит из девяти субъединиц пяти типов (3 , 3 ,  ,   и  )₃. Полипептидные цепи субъединиц   и   уложены в похожие по строению белковые глобулы, которые все вместе образуют гексамер - ансамбль, состоящий из шести субъединиц (три одинаковые субъединицы   и три одинаковые субъединицы  ). Этот ансамбль имеет вид слегка приплюснутого шара высотой 8 нм и шириной 10 нм. В центре шара находится субъединица , которая образована двумя протяженными полипептидными цепями и напоминает слегка деформированный изогнутый стержень длиной около 9 нм. Нижняя часть субъединицы   выступает из шара на 3 нм в сторону мембранного комплекса F₀ . Субъединица d расположена на внешней стороне F₁ . Внутри ансамбля ( )₃ находится минорная субъединица  , которая связана с субъединицей  . Обе эти субъединицы ( и  ) подвижны - они входят в состав своеобразного ротора, который вращается внутри неподвижного комплекса ( )₃ . 
За решающий вклад в расшифровку пространственной структуры белкового комплекса F₁ английский исследователь Джеймс Уокер в 1997 году был удостоен Нобелевской премии по химии. Свою часть премии он разделил с американским биохимиком Полем Бойером, который в течение последних 45 лет плодотворно занимался выяснением биохимических механизмов образования АТР из ADP и неорганического фосфата. 
Мембранный комплекс F₀ служит основанием, которое удерживает АТРсинтазу в мембране. Этот комплекс включает в себя протонный канал, по которому ионы водорода переносятся через АТРсинтазу. Пространственная структура F₀ расшифрована не столь детально, как строение водорастворимого комплекса F₁ . Среди изученных мембранных комплексов F₀ различного происхождения наиболее простой состав имеет F₀ из бактерии Escherichia coli, который состоит из полипептидных субъединиц трех типов (рис. 2). У E. coli в комплекс F₀ входят одна белковая субъединица типа a, две копии субъединицы b, имеющие молекулярные массы 20 и 30 кДа соответственно, а также сравнительно большое количество (n = 9-12) идентичных копий более мелкой субъединицы c (молекулярная масса 6-11 кДа). 
Субъединица а гидрофобна, она почти полностью погружена в мембрану. Ее полипептидная цепь образует шесть  -спиральных участков, которые пересекают мембрану. Субъединица b содержит лишь один сравнительно короткий  -спиральный участок, погруженный в мембрану. Остальная часть субъединицы b заметно выступает из мембраны в сторону комплекса F₁ и закрепляется за расположенную на его поверхности субъединицу   (рис. 2). Каждая из 9-12 копий субъединицы с (точное число их пока неизвестно) представляет собой сравнительно небольшой белок, состоящий из двух гидрофобных  -спиралей, соединенных друг с другом короткой гидрофильной петлей, ориентированной в сторону F₁ . Субъединицы с образуют единый ансамбль, имеющий форму цилиндра, погруженного в мембрану. Выступающая из комплекса F₁ в сторону F₀ субъединица  , по-видимому, погружена внутрь этого цилиндра и достаточно прочно зацеплена за него. На снимках АТРсинтазы, полученных недавно Уилкенсом и Капальди с помощью электронного микроскопа, видно, что два крупных белковых фрагмента АТРсинтазы (F₀ и F₁) соединены друг с другом двумя сравнительно тонкими перемычками. Одна из них расположена сбоку и представляет собой неподвижный "кронштейн" (субъединицы b), соединяющий F₀ и F₁ ; другая "ножка", расположенная в центре АТРсинтазы, является подвижной субъединицей   ротора.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ротор и статор АТРсинтазы 
Представления об АТРсинтазе как молекулярной машине, работа которой связана с ее вращением, хорошо согласуются со структурными особенностями АТРсинтазы, в которой можно выделить две группы белковых субъединиц. Одна из них образует статор мотора, который неподвижен относительно мембраны, а другая соответствует подвижному ротору, вращающемуся внутри статора (рис. 2, Б ). 
Статор включает в себя шарообразный гексамер, образованный тремя субъединицами   и тремя субъединицами  , находящуюся на его поверхности субъединицу d, а также субъединицы a и b мембранного комплекса F₀ . В этой макромолекулярной конструкции субъединицы b выполняют роль своеобразного кронштейна, связывающего неподвижные субъединицы комплексов F₀ и F₁ . К находящейся в мембране субъединице a примыкает гидрофобное кольцо, образованное субъединицами с мембранного комплекса F₀ . 
Ротор состоит из субъединиц   и  комплекса F₁ . Субъединица  , расположенная внутри комплекса ( )₃ , заметно выступает из него и соединяется с погруженным в мембрану кольцом из субъединиц с. Имеются все основания считать, что субъединица  , входящая в состав ротора, действительно вращается при работе фермента. 
Вопрос о том, в состав какого функционального узла АТРсинтазы, статора или ротора, входят субъединицы с, является спорным. Некоторые исследователи полагают, что субъединица   жестко сцеплена с кольцом из субъединиц с и во время работы АТРсинтазы кольцо из субъединиц с вращается, подобно маховому колесу, вместе с субъединицами  и  . Однако прямые экспериментальные доказательства этой гипотезы пока отсутствуют. 
В последнее время появились убедительные данные о том, что каталитическая активность АТРсинтазы непосредственно связана с вращением ее ротора. Считается, что поворот субъединицы   вызывает одновременное изменение конформации всех трех каталитических субъединиц  , что в конечном итоге обеспечивает работу фермента [4]. Вращение субъединицы  облегчается наличием своеобразной смазки в местах ее контакта с субъединицами   и  . Это обусловлено тем, что центральная часть субъединицы  , находящаяся внутри ансамбля ( )₃ , гидрофобна - она не содержит заряженных групп, взаимодействие которых с зарядами субъединиц   и  могло бы создавать дополнительное трение, препятствующее вращению субъединицы  . Однако сама по себе субъединица   не может свободно вращаться внутри комплекса  _{3 3} (за счет энергии тепловых движений). Свободному вращению ротора препятствуют стерические ограничения - субъединица  , вращающаяся вместе с субъединицей  , зацепляется за неровности внутри полости, образованной субъединицами a и b. Поэтому для того, чтобы провернуть ротор внутри статор, и тем самым заставить АТРсинтазу сделать молекулу АТР, необходим внешний источник энергии. Как уже было сказано выше, когда АТРсинтаза работает в режиме синтеза АТР (рис. 1, а), движущей силой для ее работы является энергия ионов водорода, переносимых через сопрягающую мембрану за счет протонного потенциала. При работе АТРсинтазы в режиме гидролиза АТР (рис. 1, б ) источником энергии для вращения ротора служит энергия, запасенная в молекуле АТР.

Как доказали, что  молекулярный мотор может вращаться? 
Существуют ли экспериментальные доказательства того, что работа протонных АТРсинтаз действительно связана с направленным вращением ее отдельных частей? Можно ли непосредственно увидеть вращение ротора молекулярной машины столь малого размера, какой является АТРсинтаза? Многие годы эти вопросы были предметом оживленных дискуссий среди биоэнергетиков, и лишь в последнее время на них получены утвердительные ответы. Наглядно показано, что гидролиз АТР комплексом F₁ действительно сопровождается вращением субъединицы   относительно гексамера ( )₃ . Это значит, что АТРсинтаза является молекулярной машиной, про которую можно с уверенностью сказать: "Все-таки она вертится!" Рассмотрим, как это было доказано. 

 

Рис. 3. Схемы, иллюстрирующие способы доказательства того, что  субъединица   АТРсинтазы вращается: А - изменение положения дисульфидного мостика (S-S) в результате поворотов субъединицы внутри центральной полости комплекса F1 ; Б - вращение актинового хвоста, прикрепленного к концу субъединицы  молекулы F1 , которая отделена от мембраны и зафиксирована на подложке с помощью специальных хвостиков

 

 

В работах американских биохимиков Капальди, Кросса и их сотрудников для доказательства вращения субъединицы   был использован оригинальный подход, основанный на применении искусственных химических сшивок между субъединицами   и   с помощью дисульфидных (S-S) мостиков (рис. 3, А ). Методами молекулярной генетики субъединицы   и   удалось модифицировать так, что в нужные участки полипептидных цепей этих белков были вставлены аминокислоты (цистеины), которые содержат сульфгидрильные группы (-SH). Между этими группами может образоваться ковалентная связь (-SH + HS -S-S-). Таким способом удалось пришить субъединицу    к субъединице   и тем самым блокировать возможное вращение субъединицы   внутри комплекса F₁ . Как показали опыты, ферментативная активность комплекса F₁ (его способность гидролизовать АТР) при этом была полностью подавлена. Представим теперь, что после того, как сшивка между субъединицами   и   была сделана, S-S-мостик разрывают, а затем спустя некоторое время делают новую сшивку. За положением старых и новых мостиков в молекуле F₁ можно следить с помощью меченых (радиоактивных) атомов. Понятно, что в случае покоящейся субъединицы   после повторной сшивки S-S-мостик останется в исходном положении. Однако в том случае, если после разрыва S-S-мостика в ходе работы фермента произойдет поворот субъединицы  , то может образоваться новый S-S-мостик между субъединицей   и другой субъединицей b. Именно такую картину и наблюдали исследователи, когда фермент работал, то есть гидролизовал АТР. Оказалось, что новые S-S-мостики образовывались между субъединицей   и всеми тремя субъединицами b фактора сопряжения F₁ (рис. 3, А ); этот факт свидетельствует о вращении субъединицы   во время работы F₁ . Показано также, что вращение ротора АТРсинтазы происходит не только при гидролизе АТР изолированным фактором F₁ , но и в условиях синтеза АТР мембранной АТРсинтазой в нативных системах. 
В работах немецкого биофизика В. Юнге и его сотрудников для регистрации вращательного движения субъединицы   был использован оптический метод, который позволяет изучать подвижность специальной химической метки, присоединенной к субъединице  . В качестве молекулярного зонда, сигнализирующего экспериментатору о вращении субъединицы  , был использован краситель эозин. Молекулу красителя химическим способом пришивали к субъединице  , в то время как саму глобулу ( )₃ обездвиживали, прикрепляя ее к ионообменной смоле. За изменением ориентации молекул красителя наблюдали с помощью зондирующего луча поляризованного лазерного света. Обнаружено, что характерное время изменения ориентации молекулы зонда, жестко пришитой к субъединице  , составляет ~100 мс, что практически совпадает со временем гидролиза одной молекулы АТР изолированным ферментом. Важно отметить, что вращение субъединицы   наблюдается только в случае работающего фермента, то есть когда белковый комплекс F₁ гидролизует АТР. В присутствии ингибитора, препятствующего гидролизу АТР, вращения не происходит. 
Однако самым впечатляющим доказательством того, что субъединица   действительно крутится в ходе работы фермента, стала замечательная работа, выполненная недавно группой японских исследователей [5, 6]. Киношите, Йошиде и их соавторам впервые удалось непосредственно увидеть вращение субъединицы   с помощью флуоресцентного микроскопа. Как можно разглядеть вращение ротора, диаметр которого составляет всего лишь 1 нм ? 
Чтобы наблюдать за вращением субъединицы  , к ее основанию, выступающему из комплекса F₁ , японские ученые прикрепили специальный макромолекулярный маркер - фрагмент нити актина (белок, входящий в состав мышц) длиной около одного микрона, который, в свою очередь, был помечен молекулами флуоресцирующего красителя. Остальную часть отделенной от мембраны молекулы F₁ обездвижили, пришив к субъединицам   специальные хвостики, с помощью которых F₁ прикрепили к неподвижной подложке (рис. 3, Б ). Наблюдая с помощью микроскопа за изменением положения флуоресцирующей нити актина, жестко связанной субъединицей  , удалось непосредственно увидеть ее вращение! Оказалось, что в ходе работы фермента, гидролизующего АТР, актиновый хвост крутится против часовой стрелки!! Крутится именно в том направлении, которое было предсказано на основании структурных данных, полученных группой Дж. Уокера!!! Так впервые было наглядно продемонстрировано вращение самого маленького из всех известных в природе моторов. Вместе с этим в науке окончательно утвердилось новое понятие - вращательный катализ (англ. - rotary catalysis). Вращение актинового хвоста молекулой F₁ было снято на пленку и произвело сильнейшее впечатление на всех, кому посчастливилось увидеть видеофильм о работе этого удивительно красивого, необычного и очень важного молекулярного мотора. 
В дальнейшем было показано, что молекула F₁ вращает актиновый хвост дискретными скачками с шагом, равным 120° [6]. Один скачок на 120° сопровождается гидролизом одной молекулы АТР. При этом средняя скорость вращения мотора зависит от нагрузки: чем длиннее актиновый хвост, тем больше гидродинамическое сопротивление и соответственно тем реже происходят скачкообразные повороты. Иными словами, чем выше нагрузка, тем медленнее крутится мотор. При отсутствии источника энергии (когда система не содержала молекул АТР) регулярного направленного вращения субъединицы не происходило, а наблюдались лишь очень редкие случайные повороты в обоих направлениях, обусловленные тепловыми движениями. 
Замечательным качеством вращающегося мотора АТРсинтазы является его исключительно высокий коэффициент полезного действия (КПД). Показано, что работа, которую совершает мотор при повороте актинового хвоста на 120°, почти в точности равна энергии, запасенной в молекуле АТР. Это означает, что КПД работы мотора близок к 100%.