Трансляция - синтез белка

Трансляция - синтез белка

 

 

Лекция 8. Трансляция - матричный  синтез белка в клетке. Подготовительный этап. Структура рибосом

 

Синтез белка в клетке состоит из двух этапов: рекогниции и собственно синтеза полипептида на рибосоме. Ключевым субстратом рекогниции является транспортная РНК.

 

Структура транспортной РНК

 

Транспортные РНК (tPHK) - короткие молекулы (70-90 нукл.), имеющие и вторичную, и третичную структуру.

Вторичная структура - "клеверный  лист". Последовательность ССА на 3'-конце одинакова для всех tPHK. К концевому аденозину (А) присоединяется аминокислота.

Наличие в tPHK тимина (Т), псевдоуридина (ψ) (в ТψС- петле ), и дигидроуридина (ДГУ) (в D-петле) - минорных, т.е. редко встречающихся в РНК нуклеотидов, указывает на особенности ее строения, необходимые для безошибочного узнавания ферментами, для защиты от действия рибонуклеаз (поэтому tPHK - долгоживущие, в отличие от тРНК).

Третичная структура в  проекции на плоскость имеет форму  бумеранга.

Разнообразие первичных  структур

tРНК – 61+1 кодонов (соответственно числу

 антикодонов в tРНК) формилметиониновая tPHK, у которой антикодон такой же, как у метиониновой tPHK.

Разнообразие третичных  структур

- 20 (по количеству аминокислот).

 

 

 

 

 

 

Рекогниция

 

Определение:

Рекогниция - это подготовительный этап трансляции, суть которого в образовании ковалентной связи между tPHK и соответствующей аминокислотой.

Состоит из двух стадий:

1.                     Активирование аминокислоты.

2.                     Присоединение аминокислоты к  tPHK - аминоацилирование.

Обе стадии рекогниции осуществляются ферментом аминоацил-tРНК-синтегазой (АРС-азой, кодазой). Существует 20 вариантов кодаз (по числу аминокислот). У каждой кодазы 3 центра опознавания. Каждая АРС-аза узнает третичную структуру tPHK.

 

 

Определение

tPHK, имеющие разную первичную, но одинаковую третичную структуру, акцептируют одну и ту же аминокислоту и называются изоакцепторными tPHK.

Есть особая tPHK, которая называется формилметиониновой tPHK. Она узнается метиониновой кодазой, соединяется с метионином и уже после реакции аминоацилирования метионин формилируется специальным ферментом, который узнает эту особую форму tPHK.

Именно с формилметионина начинается синтез любого полипептида у прокариот.

Определение: аминоацилирование - это образование связи между аминокислотой и tPHK.

Следующий этап трансляции - собственно синтез полипептидов, происходит на рибосомах.

 

Структура рибосом

 

Рибосомы - немембранные самые мелкие клеточные органеллы, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке Е. coli присутствует около 103-5x103 рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290Å. У эукариот - 220 х 320Å.

Выделяют четыре класса рибосом:

1.                     Прокариотические 70S.

2.                     Эукариотические 80S.

3.                     Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов).

4.                     Рибосомы хлоропластов (70S у высших  растений).

Определение: S - коэффициент  седиментации или константа Сведберга. Отражает скорость осаждения молекул или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного веса.

Каждая рибосома состоит  из 2-х субъединиц (большой и малой).

 

 Прокариотическая рибосома Эукариотическая рибосома

70S 80S

50S 30S 60S 40S

5S rРНК

23SrРHK 

16SrPHK 5S rРНК

5.8SrPHK

28S rPHK 

18S rPHK

 

34 молекулы белков, из них  31 разные 

21 белок не менее 50 разных белков не менее 33 разных белков

 

 Сложность объясняется  тем, что все элементы рибосом  представлены в одном экземпляре, за исключением одного белка,  присутствующего в 4 копиях в  50S субъединице, и не могут быть  заменены.

rРНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.

23S гРНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16SrРНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона mPHK, 5SrРНК - для правильной ориентации аминоацил-tPHK на рибосоме.

Все rРНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.

rРНК в значительной степени метилированы (СН3-группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).

Порядок сборки субъединиц из rРНК и белков строго определен. Субъединицы, не соединенные друг с другом, представляют собой диссоциированные рибосомы. Соединенные - ассоциированные рибосомы. Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg2+ (до 2x103 ионов на рибосому). Магний нужен для компенсации отрицательного заряда гРНК. Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg2+ (в меньшей степени - марганца Мn2+).

 

Каталитические центры рибосом

 

Асп - центр специфического

узнавания. Здесь происходит взаимодействие кодон-антикодон.

Р-центр - пептидильный, донорный.

Он является донором формилметио-нина при инициации, или пептидила при элонгации трансляции.

А-центр - аминоацильный, акцепторный.

Акцептирует формилметионин в самом начале или пептидил при элонгации трансляции.

 

К-центр - каталитический (фермент  пептидилтрансфераза). В К-центре задействована 23S гРНК и несколько белков большой субъединицы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Лекция 12. Репликация. Принципы. Синтез ДНК in vitro

 

Репликация ДНК

 

Определение

Репликация — это процесс, осуществляемый комплексом ферментов  и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов, называют репликацией ДНК.

 

Принципы репликации

1. Комплементарность.

2. Антипараллельность.

3. Униполярность.

4. Потребность в затравке.

5. Прерывистость.

6.Полуконсервативность.

 

Первые три принципа можно  сформулировать в одной фразе:

Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно  матричной цепи и всегда в направлении 5'→ 3'.

 

Доказательство полуконсервативного  характера репликации

Для выяснения вопроса  о характере расхождения цепей  по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958 г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. .

ДНК разделяется не по молекулярным весам, а по удельной плотности.

E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N15), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки синхронизировали. При этом в среде заменяли N15 на легкий изотоп N14 с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl.

Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.

 

Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми  молекулами исключало возможность  консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая - вновь  синтезированную, обе цепи которой  являются новыми.

Клетки второго поколения  содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие  из одной "легкой" и одной "тяжелой" цепи, аналогичные молекулам первого  поколения. Этот факт исключал возможность дисперсного механизма, согластно которому куски материнской ДНК случайным образом распределяются между дочерними молекулами.

 

Ферментативная система  синтеза ДНК in vitro

В 1956 г. Артур Корнберг наработал 100 кг биомассы E. coli и выделил 0.5 г фермента ДНК-полимеразы.

Необходимые компоненты для  синтеза ДНК in vitro:

1. ДНК-матрица - образец,  по которому строится новая  цепь ДНК. 

2. Активированные нуклеотиды (dАТФ, dГТФ, dТТФ, dЦТФ) - то, из чего строятся дочерние цепи.

3. ДНК-полимераза - то, что  строит новую цепь ДНК.

4. Ионы магния - то, без  чего фермент не работает.

ДНК-матрицу необходимо активировать.

Нативная двуцепочечная ДНК, не имеющая повреждений, не может эффективно использоваться в этой системе. Активировать ее можно либо денатурацией щелочью или нагреванием (1), либо обработкой экзонуклеазой III из E. сoli (2), либо внесением ников (одноцепочечных разрывов) с помощью эндонуклеаз (3).

 

Понятие о матрице и  затравке

Продукты, образуемые в ферментативной системе in vitro.

 

 

Во всех случаях матрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.

В том случае, если эндонуклеаза вносила ники с 3'-фосфатным концом, ДНК не являлась активированной.

Прямым доказательством  того, что затравка - 3'-гидроксильный  конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом.

 Если такой активированный  нуклеотид сделать меченым по  α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет 3'-гидроксильного конца.

Это также доказывает и  униполярность репликации в направлении 5' →3'.

Строение и свойства ДНК-полимеразы Корнберга (ДНК-полимеразы I)

ДНК - полимераза Корнберга (ДНК-полимераза I) - это одна полипептидная цепь с молекулярным весом 109 тыс.

В состав полимеразы входят ионы цинка. Она абсолютно зависима от ионов магния.

Обнаружено 4 разные каталитические активности ДНК - полимеразы I:

1. Полимеризационная в направлении 5`→3`.ДНКn+dХТФ →ДНКn+1 + Ф-Ф

2. Пирофосфоролиз: ДНКn+Ф-Ф*ДНКn-1 + dХТФ* Эта активность возможна при большом избытке пирофосфатов.

3.Пирофосфатный обмен:  ДНКn + dХТФ + Ф-Ф*→ДНКn+ dХТФ* + Ф-Ф

 Фермент работает только  тогда, когда он находится на  молекуле ДНК и имеет соответствующую  конформацию.

4.Гидролитическая активность: ДНКn + Н2О→ДНКn-1 + dХMФ

Эта активность имеет большой  биологический смысл. Гидролитическая  активность проявляется в направлении 3'5' и 5'3'.

Активность 3' 5' проявляется  на неспаренном 3'-гидроксильном конце. Фермент возвращается при ошибке включения и "откусывает" неправильный нуклеотид.

Это корректорская функция  фермента.

Все ДНК-полимеразы обладают этой активностью.

Фермент способен гидролизовать спаренный 5'-конец, расчищая себе дорогу и продолжая полимеризацию.

 

Если на пути фермента встречается  короткий (меньше 10 нуклеотидов) неспаренный 5'-конец, то полимераза сначала проявляет  эндонуклеазную активность и откусывает весь свисающий конец, а затем проявляет экзонуклеазную 5'3' активность т.е. откусывает по одному нуклеотиду.

Если неспаренный 5'-конец  длинный, то фермент использует его  как матрицу.

 

 Примягком расщеплении ДНК-полимеразы трипсином можно получить два активных фрагмента: один обладает полимеразной и 3'→5' гидро-литической активностью (фрагмент Кленова), другой - 5'3' гидролитической активностью