Транскрипционный контроль экспрессии генов у прокариот

Функционирование  аттенюаторов – регулируемых  терминаторов транскрипции бактерий, которые были рассмотрены в разделе 2.1.3, сопряжено с синтезом лидерного пептида рибосомами. Этот тип регуляции используется грамотрицательными бактериями для изменения уровня транскрипции многих оперонов,  контролирующих  биосинтез  аминокислот.  Как  уже  упоминалось, отличительной  чертой  такого  типа  регуляции  является  образование альтернативных вторичных структур РНК, которые формируются под влиянием рибосом, прекращающих трансляцию на кодонах аминокислот, которые клеткам необходимо  синтезировать.  В  дополнение  к  этому,  как  прокариоты,  так  и эукариоты  обладают  способностью  реагировать  на  многие  внеклеточные  и внутриклеточные процессы изменением скорости элонгации транскриптов. Влияние условий роста бактериальных клеток на элонгацию цепей РНК.  Механизмы  преждевременной  терминации  транскрипции  и антитерминации  интенсивно  используются  бактериями  для  регуляции внутриклеточного  метаболизма  при  изменении  условий  роста  клеток.  В частности, скорости синтеза рРНК и тРНК строго координированы со скоростью роста, и наоборот, число делений клеток в единицу времени прямо зависит от скорости  транскрипции  соответствующих  оперонов.  Совокупность  событий, развивающихся у бактерий в ответ на изменение скорости их роста, например при изменении содержания питательных веществ в среде, получила название строгого ответа (stringent response). Первичной сигнальной молекулой строгого ответа является гуанозинтетрафосфат – ppGpp, который уменьшает скорость элонгации  РНК-полимеразой  и  вызывает  преждевременную  терминацию транскрипции в rrnB-опероне.

Транскрипция  оперонов  рибосомных  белков  также  контролируется  на уровне  элонгации.  В  частности,  у E. coli транскрипция  оперона,  кодирующего рибосомный  белок S10 и  десять  других  рибосомных  белков,  контролируется через  задержку  транскрипции,  для  реализации  которой  используется  продукт третьего гена оперона – рибосомный белок L4. Этот белок взаимодействует со шпилькой  синтезируемой  РНК,  вызывая  преждевременную  терминацию транскрипции в лидерном участке гена S10 – первом гене оперона. В отличие от классической аттенюации альтернативные вторичные структуры РНК в этом случае  не  являются  причиной  изменения  эффективности  транскрипции соответствующего  участка  ДНК.  Белок L4 связывается со  шпилькой  на 70–80 нуклеотидов выше сайта терминации транскрипции. Шпилька в синтезируемой РНК образуется выше сайта терминации независимо от присутствия белка L4, однако  без  него  молекула  РНК-полимеразы  не  замечает  сигнала  терминации транскрипции. Этот механизм предотвращает накопление в клетке свободных рибосомных белков, не включившихся в состав рибосомных субчастиц.

Транскрипция  оперона  биосинтеза  пиримидинов  у E. coli регулируется как на уровне элонгации, так и на этапе освобождения промотора. Первый тип регуляции является еще одним примером классической аттенюации, тогда как во втором случае реализуется нетривиальный механизм. Оперон индуцируется в присутствии низких внутриклеточных концентраций UTP. При повышении ее содержания  транскрипционный  комплекс  продолжает  эффективно формироваться  на  промоторе,  однако  во  время  инициации  РНК-полимераза начинает  реитеративный синтез гомополимера. Синтезируются длинные цепи поли(U), а в продуктивную фазу синтеза РНК фермент не вступает, потому что не может покинуть промотор. Недавно тот же механизм контроля был описан для  оперона  codBA E. coli. По  мнению  М. Чамберлина (1997 г.)  аналогичный механизм может функционировать и у эукариот. В  отличие  от  только  что  рассмотренного  механизма  контроля пиримидинового  оперона  регуляция  транскрипции  оперона  purB E. coli осуществляется на уровне элонгации РНК с помощью пуринового репрессора – ДНК-связывающего  белка,  взаимодействующего  со  специфической последовательностью нуклеотидов. Оперон purB является одним из девяти pur-оперонов,  и  два  других  гена  также  контролируются  пуриновым  репрессором.

Однако только в опероне purB репрессор взаимодействует с ДНК значительно ниже  сайта  инициации  транскрипции  и  создает  препятствие  элонгирующей РНК-полимеразе. Этот эффект не зависит от purB-промотора и не сопряжен с трансляцией.

У B. subtilis регуляция  транскрипции  оперонов  биосинтеза  пуринов  и пиримидинов  также  связана  с  задержкой  синтеза  РНК,  однако  используемый при этом механизм отличается от такового у E. coli. В этом случае первичными регуляторами  транскрипции  являются  уже  не  рибосомы,  а  новые  белки, которые распознают другие элементы вторичной структуры РНК. В частности, было  предсказано  образование  альтернативных  шпилек  в  РНК  пуринового оперона  под  действием  РНК-связывающего  белка,  ассоциированного  с гуанином. Реализуемый механизм оказался аналогичным механизму репрессии биосинтеза триптофана, о котором подробнее речь пойдет ниже.

Из  общих  соображений  можно  предположить,  что  биосинтез предшественников  РНК,  необходимых  для  синтеза  пуринов  и  пиримидинов, должен оказывать прямое влияние на транскрипцию через изменение уровней соответствующих  нуклеотидов.  Действительно,  у  дрожжей,  дефектных  по фактору  элонгации EFIIS, стимулирующему  элонгацию  РНК  у  эукариот, наблюдается  повышенная  чувствительность  к 6-азаурацилу,  который уменьшает внутриклеточный пул GTP и UTP. К такому же фенотипу приводили и  некоторые  мутационные  изменения  субъединиц  РНК-полимеразы II S. cerevisiae.  Для  некоторых,  хотя  и  не  для  всех  мутантных  РНК-полимераз этого  типа,  были  характерны  нарушения  в  элонгации  транскриптов  или взаимодействии с факторами элонгации in vitro. Все это еще раз указывает на универсальный  характер  тонкой  координации  в  клетках  метаболизма нуклеотидов и синтеза РНК.

Регуляция  транскрипции  не  всех  бактериальных  оперонов  биосинтеза

аминокислот у бактерий следует сценарию аттенюации, характерному для trp-, his-, leu- и ilv-оперонов E. coli. В частности, транскрипция trp-оперона B. subtilis также  регулируется  на  уровне  элонгации,  однако  в  этом  случае  в  регуляции участвует  РНК-связывающий  белок TRAP, который,  кроме  того,

взаимодействует с триптофаном. После образования комплекса с триптофаном белок TRAP приобретает  способность  связываться  с  РНК  оперона  в  ее лидерном участке. Такое взаимодействие модифицирует вторичную структуру РНК,  что  способствует  терминации  транскрипции.  Более  того,  белок TRAP может  оказывать  негативное  влияние  на  трансляцию  полицистронной  мРНК оперона при повышении внутриклеточного содержания триптофана. В отличие от E. coli на  процесс  транскрипции trp-оперона  у B. subtilis рибосомы  не оказывают прямого влияния.

Сопряжение  транскрипции  и  репарации  ДНК.  Многие  повреждения ДНК  вызывают  прекращение  элонгации  транскриптов  у  бактерий  и  эукариот, вызывая  переход  элонгирующего  транскрипционного  комплекса  в  неактивное состояние. При этом преимущественно репарируются транскрибируемые цепи ДНК.  Обнаружены  белковые  факторы,  осуществляющие  сопряжение транскрипции  с  репаративным  синтезом  ДНК.  В  частности,  бактериальный белковый комплекс UvrAB, участвующий в репаративной эксцизии (вырезании) нуклеотидов (NER – см.  раздел 5.2.2), может  непосредственно взаимодействовать  с  β-субъединицей  РНК-полимеразы,  а  также  с одноцепочечными участками ДНК в составе открытых промоторных и тройных элонгирующих  комплексов.  У E. c oli некоторые  из  этих  воздействий обеспечивают  контакты  между  молекулами  РНК-полимеразы,  прекратившей элонгацию  цепей  РНК,  и  репарирующим  комплексом,  который  с  помощью фактора,  сопрягающего  транскрипцию  и  репарацию,  выводит  элонгирующий комплекс  из  состояния  прекращения  транскрипции.  Не  все  повреждения  ДНК оказывают  влияние  на  элонгацию  транскриптов  РНК-полимеразой.  Например, РНК-полимеразы как фага SP6, так и E. coli эффективно преодолевают в ДНК бреши, не содержащие азотистых оснований. При прохождении таких участков ДНК молекулы РНК-полимераз обычно включают остатки AMP в элонгируемую РНК независимо от матрицы.

Контроль  элонгации  РНК  у  бактериофагов.  Во  время  вирусной инфекции  размножающиеся  вирусы  овладевают  контролем  над  экспрессией генов  клетки-хозяина  и  используют  ее  для  своих  собственных  нужд,  что является  общим  свойством  всех  внутриклеточных  паразитов  и  симбионтов. Многие  из  бактериофагов  осуществляют  контроль  транскрипции  на  уровне элонгации.

Бактериофаг  λ.  Механизмы  контроля  транскрипции  на  уровне элонгации  РНК  у  этого  бактериофага  изучены  лучше,  чем  у  других  вирусов.

Ключевые  регуляторные  фаговые  белки N и Q контролируют  транскрипцию всего  фагового  генома,  обеспечивая  антитерминацию  транскрипции  в  местах обычного  прекращения  синтеза  вирусных  РНК,  т.е.  на  терминаторах транскрипции. В результате происходит транскрипция всех генов, необходимых для размножения бактериофага, и он вступает на вирулентный путь развития, приводящий к лизису бактериальных клеток и выходу зрелых фаговых частиц в окружающую  среду.  Механизм  антитерминации,  обеспечиваемой N-белком, отличается от механизма Q-зависимой антитерминации. N-Белок осуществляет свои  функции  при  прохождении  элонгирующей  РНК-полимеразой  особых последовательностей ДНК (бокс А и бокс В), обеспечивающих сборку комплекса элонгирующей РНК-полимеразы и N-белка. Белок N сам по себе является РНК-связывающим  белком,  и  его  взаимодействие  с  РНК  стабилизируется Nus-белками E. coli. Его  объединение с  РНК  и комплексом сопутствующих  белков заставляет  элонгирующую  РНК-полимеразу  не  замечать  сигналы  терминации на  ДНК,  как  зависимые,  так  и  не  зависимые  от  факторов  терминации транскрипции.

Во  время  антитерминации  транскрипции,  опосредуемой Q-белком, последний  взаимодействует  с  нетранскрибируемой  цепью  ДНК  промоторного или  элонгирующего  комплексов  в  пределах  первых 20–25 нуклеотидов  ниже точки инициации транскрипции позднего фагового промотора. При этом белок Q не  образует  комплекса  с  РНК  и  оказывает  свое  действие  на  транскрипцию через  регуляторную  субъединицу  РНК-полимеразы  σ70.  Для  реализации Q-зависимой  антитерминации in vivo необходимо,  чтобы  произошла  задержка  в перемещении  элонгирующей  РНК-полимеразы  вдоль  матрицы  вскоре  после инициации  транскрипции.  В  это  время  уже  освободившаяся  из транскрипционного  комплекса  σ-субъединица  входит  в  контакт  с нетранскрибируемой  цепью  ДНК  в  открытом  участке (транскрипционном пузырьке),  расположенном  на 15 нуклеотидов  ниже  точки  инициации транскрипции.  Таким  образом,  σ-субъединица  остается  ассоциированной  с транскрибирующим комплексом и опосредует антитерминирующее действие Q-белка на больших расстояниях (несколько тысяч пар оснований) от промотора.

В  этом  случае  совместное  действие  фактора  инициации  транскрипции (σ-субъединицы) и ДНК-связывающего белка-антитерминатора изменяют свойства элонгирующей  РНК-полимеразы,  которая  освобождает  промотор  после кратковременной паузы в элонгации. Эти необычные свойства σ-субъединицы, проявляемые  во  время  вирусной  инфекции,  позволяют  высказывать предположение  о  ее  возможном  участии  в  контроле  транскрипции бактериальных генов на уровне освобождения промотора и элонгации синтеза РНК.

Лямбдоидный бактериофаг HK022. При заражении клеток E. coli этим

бактериофагом  происходит  исключение (подавление  развития)  фага  λ,  в котором участвует вирусный белок nun. Этот белок, родственный белку N фага λ, также участвует в контроле элонгации РНК у бактериофага HK022. Во время λ-инфекции Nun-белок  нарушает  функционирование N-белка,  предотвращая антитерминацию синтеза РНК и вызывая его терминацию. При этом оба белка взаимодействуют  с  одними  и  теми  же  последовательностями  РНК,  однако оказывают  противоположное  действие  на  элонгирующий  транскрипционный комплекс.  Бактериофаг HK022 обладает  собственной  регуляторной  системой антитерминации  транскрипции,  для  функционирования  которой  не  требуется белок Nun, но необходима  его мРНК.  В  этом  случае  элонгирующий  комплекс перестает узнавать терминаторы транскрипции после прямого взаимодействия Nun-РНК  с  β’-субъединицей  РНК-полимеразы.  Для  осуществления антитерминации  по  такому  механизму  не  требуется  участия  других  вирусных белков.

Бактериофаг  Т4.  Бактериофаг  Т4  использует  бактериальную  РНК-полимеразу  для  транскрипции  своего  собственного  генома,  ингибируя  синтез РНК  бактериальной  клетки-хозяина.  В  подавлении  транскрипции  участвует фаговый  белок Alc, взаимодействующий  с  β-субъединицей  РНК-полимеразы E. coli,  что  сопровождается  прекращением  транскрипции  матричных  ДНК, содержащих остатки цитозина. Т4-ДНК содержит вместо остатков С остатки 5-гидроксиметилцитозина и эффективно транскрибируется РНК-полимеразой как в  присутствии Alc-белка,  так  и  без  него.  В  отличие  от  этого  матричные  ДНК, содержащие  немодифицированные  остатки  С,  не  транскрибируются бактериальной  РНК-полимеразой  только  в  присутствии  белка Alc, и  даже простое  метилирование  остатков  цитозина  в  положении  С5  обеспечивает защиту  транскрипции  от  преждевременной  терминации,  вызываемой  этим белком.

Координация  элонгации  транскриптов  с  метаболизмом  ДНК. Транскрипция происходит координированно с репликацией бактериальной ДНК и  сегрегацией  хромосом  в  дочерние  клетки.  Транскрибирующая  РНК-полимераза  часто  встречается  в  процессе  синтеза  РНК  с  репликативным бактериальным  комплексом.  Для  сведения  к  минимуму  отрицательного эффекта такой встречи активно транскрибируемые гены E. coli, других бактерий и бактериофагов ориентированы на хромосомах таким образом, чтобы синтез ДНК и РНК происходил в одном направлении. Но даже в этом случае встреча двух  работающих  комплексов  неизбежна,  поскольку  репликация  ДНК происходит  в 10–20 раз  быстрее  транскрипции  тех  же  ее  участков.