Теоретические основы биотехнологии

Известно, что многие ценные лекарственные растения нельзя культивировать в России из-за климатических условий.   Предложите возможности решения этой проблемы с помощью биотехнологии.

Мир растений определяет благополучие человечества. Известно,что 1,9 млрд. тонн (∼99 %) употребляемого сухого вещества человечество получает из растений. Растения широко используют в различных областях производства: сельское хозяйство, получение продуктов питания, строительство, производство тканей, бумаги и энергии. Особый интерес представляет получение различных химических соединений, биологически активных веществ (БАВ), из которых производят лекарственные препараты (фитопрепараты), химикаты для сельского хозяйства и пр. Существенное увеличение урожая сельскохозяйственных культур в ХХ веке достигнуто за счет химизации, механизации и мелиорации сельского хозяйства, что привело к загрязнению окружающей среды, истощению энергетических ресурсов, возрастанию затрат на единицу продукции. Кроме того, дополнительный прогресс в улучшении сельскохозяйственных культур в большинстве случаев достиг своего предела. Поэтому крайне необходимы поиск и внедрение новых подходов. Среди новых подходов к этой проблеме наиболее перспективным является применение клеточной инженерии (синоним: клеточная и тканевая биотехнология). Клеточная инженерия (клеточная и тканевая биотехнология) основана на использовании принципиально нового метода – метода изолированной культуры клеток эукариотических организмов (растений, животных). Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах (in vitro) в стерильных условиях получило название метода культуры изолированных тканей.

1.ТЕХНИКА ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ И МЕТОДЫ КУЛЬ- ТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И РАСТЕНИЙ.

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности.

                                               1.1.Стерилизация. 

Изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорга- низмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160оС в течение 1,5 – 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120оС и давлении 0.75 – 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40С. Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой  с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 1. Таблица 1 Стерилизация исходного растительного материала (по Р.Г.Бутенко, 1999) Время стерилизации, мин Объект диацид сулема 0,1% перекись водорода 10-12%

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружные слои клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации. Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробы внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик. 

                                                1.2.Питательные среды. 

Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. Они могут существенно разли- чаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и микроэлементы, углеводы, витамины. Фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) входят в состав любой питательной смеси в концентрации 2-3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способны к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды зна- чительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Однако изначально низкое содержание фосфатов в питательной среде способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Установлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличивает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, конский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). В качестве дополнительного источника азота в состав сред добавляют аминокислоты или гидролизат казеина – источник аминокислот. В состав сред включают водорастворимые витамины; тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновую кислоту, пиридоксин, аскорбиновую кислоту. Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны. К ним относятся ауксины, вызывающие дифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

                    1.3.Влияние физических факторов.

На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы – свет, температура, аэрация, влажность.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и её физиологические особенности влияет качество света.

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26°С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфогенеза требует более низких температур (18-20°С).

 Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должны составлять 60-70%.

Для решения проблем рентабельности производства, его экологичности, управляемости производственным процессом, повышения качества получаемых лекарственных средств используют иммобилизацию микроорганизмов и растительных клеток. Укажите преимущества этого метода на примере получения гормональных препаратов стероидной структуры.

Иммобилизация – физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и растворителя, то есть биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем.  Биообъект может работать в этом случае многократно (неделя, месяц). Другими словами можно сказать, что иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением           ( частичным или полным) каталитической активности.

                          2.1.Преимущества иммобилизации биообъекта:

1. многократность использования  ферментов и живых клеток в  наиболее продуктивной фазе 

2. снижение количества отходов  производства 

3. повышение качества целевого  продукта (он менее загрязнен), более  простое выделение целевого продукта (особенно важно для производства инъекционных лекарственных препаратов, когда в продукте мало белка – нет пирогенности и аллергенности).

4. биотехнологический процесс становится  более стандартным, более предсказуемым.

5. устойчивость к внешним воздействиям.   

2.2.Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют следующие методы:

1. Ковалентное присоединение молекул  ферментов к водонерастворимому  носителю, в качестве которого  используют как органические (природные  и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К природным материалам относятся целлюлоза, хитин, агароза, декстраны, бумага, ткани, полистирол, ионообменные смолы и так далее.

2. Захват фермента в сетку  геля или полимера.

3. Ковалентная сшивка (сшивание) молекул фермента друг с другом или с инертными белками при помощи би- или полифункционального реагента.

4. Адсорбция фермента на водонерастворимых  носителях (часто на ионитах) 5. Микрокапсулирование (захват раствора фермента в  полупроницаемые капсулы размером 5-300 миллимикрон). Такая ситуация приводит к совершенствованию технологических процессов. В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов – их можно удалять из реакционной смеси (и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией. Кроме того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизованными ферментами.

           Ограничения метода иммобилизации: • если целевой продукт не выходит в среду растворителя, а накапливается внутри клетки, то работать с иммобилизованным продуктом нет смысла. • Ферменты тоже не всегда можно иммобилизовать, например, если у фермента есть кофермент, который с ним не прочно связан. Кофермент можно вводить в среду, но это не всегда бывает возможно в условиях производства. 

                2.3.Пути иммобилизации ферментов и целых клеток 

1. Адсорбция на нерастворимом  носителе( на окиси алюминия, угле, смолах, карбоксиметилцеллюлозе и др.) Адсорбция имеет недостаток, так как связи ( в основном ионные) могут быть недостаточно прочными и разрушаться под воздействием рН и других факторов, при этом биообъект снимается с носителя. В производстве используется редко. 2. Адсорбция на аффинном носителе (избирательная сорбция к определенной группе веществ) 3. Ковалентное связывание. Носитель активируют, например ПААГ активируют бромцианом или глутаровым альдегидом. Носитель не должен быть токсичным для биообъекта. Максимальная нагрузка носителя – это максимальное количество фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя. Чем она больше, тем лучше.

4. Включение биообъекта в носитель  или инкапсулирование Биообъект  включается в ячейки геля, субстрат проникает в ячейки, а целевой продукт свободно выходит. Сложности, возникающие при инкапсулировании. Если биообъект – изолированный очищенный фермент, то для его включения в гель ячейки не должны быть слишком большими. Но, если ячейки слишком маленькие, то затруднен контакт с субстратом и необходимо подбирать условия, чтобы субстрат свободно проникал и свободно уходил целевой продукт. Если биообъект – клетки, то ячейки должны быть достаточно большими. Необходим достаточный доступ к клеткам кислорода и отведения углекислого газа. Связь с гелем не очень прочная и биообъект может вымываться