Технология получения гормона роста

СОДЕРЖАНИЕ

Введение	7
Основная часть
1.1 Биологическая роль, история  открытия, возможность использования  и общая характеристика способов получения соматропина (гормона роста)	8
1.2 Технология получения  соматропина	12
1.2.1 Штаммы-продуценты, их  получение и поддержание чистоты	112
1.2.2 Технология получения  соматропина	112
1.2.3 Методы выделения,  очистки конечного продукта	113
1.2.4 Условия хранения соматропина	118
Заключение	119
Список использованной литературы	220

 

 

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Гипофиз — мозговой придаток в форме округлого образования, расположенного на нижней поверхности головного мозга в костном кармане, называемом турецким седлом, вырабатывает гормоны, влияющие на рост, обмен веществ и репродуктивную функцию. Является центральным органом эндокринной системы; тесно связан и взаимодействует с гипоталамусом.

Рекомбинант — организм (или клетка), образовавшийся из зиготы с генетическим материалом, перераспределенным в результате рекомбинации.

Супернатант — надосадочная жидкость, жидкая фаза, остающаяся после осаждения нерастворимого материала (напр., с помощью центрифугирования).

Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков.

Продуце́нты — организмы, способные синтезировать органические вещества из неорганических, то есть, все автотрофы. Это, в основном, зелёные растения (синтезируют органические вещества из неорганических в процессе  фотосинтеза), однако некоторые виды  бактерий -хемотрофов способны на чисто химический синтез органики без солнечного света.

Репарация  — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов.

Анаболические средства — вещества, действие которых направлено на усиление анаболических процессов в организме, то есть вещества, ускоряющие образование и обновление структурных частей клеток, тканей и мышечных структур.

 

 

 

ОБОЗНАЧЕНИЯ И  СОКРАЩЕНИЯ

 

В настоящей работе применяют  следующие обозначения:

%;  мг/л; мг; мл; об/мин; ч; кДа; °С; мин. – единицы измерения.

 

В настоящей работе применяют  следующие сокращения:

кДа            – килодальтон

ДНК            – дезоксирибонуклеиновая кислота

рН             – кислотность раствора

РНК             – рибонуклеиновая кислота

Е.coli          – Escherichia coli (кишечная палочка)

S.cerevisiae – Saccharomyces cerevisiae 

ВВЕДЕНИЕ

В данной работе приведен анализ широко применяемой технологии получения гормона роста (соматотропина) с помощью генной инженерии. На сегодняшний день соматотропин используется как лекарственный препарат.

Развитие с середины 1970-х  годов  технологии получения рекомбинантных ДНК, значительно изменило характер исследований, проводимых в области генетики, биологии развития и эволюции. Разработка методов клонирования ДНК и проведения полимеразной цепной реакции позволяют получать в достаточном количестве необходимый генетический материал, включая рекомбинантные (гибридные) ДНК. Эти методы используются для выяснения тонкой структуры генетического аппарата и отношений между генами и их специфическими продуктами - полипептидами. Вводя в клетки рекомбинантную ДНК, удалось получить штаммы бактерий, способные синтезировать важные для медицины белки, например человеческий инсулин, гормон роста человека и многие другие соединения. [1]

Гормон роста (соматотропный  гормон, СТГ, соматотропин, соматропин)) — один из гормонов передней доли гипофиза. Относится к семейству полипептидных гормонов, в которое входят также пролактин и плацентарный лактоген. Сферы применения разнообразны: лечение карликовости, терапия больных синдромом иммунодефицита, борьба со старением организма и лишним весом, лечение травм, наращивание мышечной массы у спортсменов. [2]

Цель курсовой работы заключается в анализе рекомбинантного способа получения гормона роста.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие  задачи:

1. Изучить методы получения гормона.
2. Описать получение СТГ биотехнологическим путем.
3. Сделать соответствующие выводы по данной курсовой работе.

 

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Биологическая роль, история открытия, возможность использования и общая характеристика способов получения соматропина (гормона роста).

Соматотропный гормон  (СТГ)  обладает широким спектром биологического действия. Он влияет на все клетки организма, определяя интенсивность обмена углеводов, белков, липидов и минеральных  веществ. Он усиливает биосинтез  белка, ДНК, РНК, гликогена и в  то же время способствует мобилизации  жиров из депо и распаду высших жирных кислот и глюкозы в тканях. Помимо активации процессов ассимиляции, сопровождающихся увеличением размеров тела, ростом скелета, СТГ координирует и регулирует скорость протекания обменных процессов. Кроме того, гормон роста  человека и приматов (но не других животных) обладает измеримой лактогенной активностью. Предполагают, что многие биологические эффекты этого гормона осуществляются через особый белковый фактор, образующийся в печени под влиянием гормона. Этот фактор был назван сульфирующим или тимидиловым, поскольку он стимулирует включение сульфата в хрящи, тимидина – в ДНК, уридина – в РНК и пролина – в коллаген. По своей природе этот фактор оказался пептидом с молекулярной  массой 8000. Учитывая его биологическую роль, ему дали наименование «соматомедин», т.е. медиатор действия СТГ в организме. Соматропин регулирует процессы роста и развития всего организма, что подтверждается клиническими наблюдениями. Так, при гипофизарной карликовости (патология, известная в литературе как пангипопитуитаризм; связана с врожденным недоразвитием гипофиза) отмечается пропорциональное недоразвитие всего тела, в том числе скелета, хотя существенных отклонений в развитии психической деятельности не наблюдается. У взрослого человека также развивается ряд нарушений, связанных с гипо- или гиперфункцией гипофиза. Известно заболевание акромегалия (от греч. akros – «конечность», megas – «большой»), характеризующееся непропорционально интенсивным ростом отдельных частей тела, например рук, ног, подбородка, надбровных дуг, носа, языка, и разрастанием внутренних органов. Болезнь вызвана, по-видимому, опухолевым поражением передней доли гипофиза. Такая характеристика гормона связана с его химической структурой. Соматотропин белковый гормон. Молекула этого гормона представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 190-191 аминокислотных остатков (молекулярная масса около 22 тыс.). По химической структуре, физико-химическим и биологическим свойствам соматотропин сходен с пролактином и плацентарным лактогеном, и поэтому объединяется с ними в одно семейство. Считается, что эти три гормона произошли в процессе эволюции из общего предшественника. [3]

Установлена первичная структура соматотропина человека и нескольких видов животных. Соматотропины разной видовой принадлежности, обладая большими или меньшими различиями в аминокислотной последовательности, проявляют четкую структурную гомологию друг с другом. Все они содержат один остаток триптофана и 4 остатка цистеина. Последние образуют в молекуле два дисульфидных мостика, которые формируют две петли-большую, включающую центральный участок аминокислотной последовательности (в соматотропине человека между цистеином-54 и цистеином-165), и малую (на С-концевом участке между цистеином-182 и цистеином-189). Высокое содержание в молекуле соматотропина остатков неполярных аминокислот обусловливает большую склонность к образованию в растворе димеров и более крупных агрегатов.

Пространственную структуру молекулы соматотропина отличает высокая степень упорядоченности. В полипептидной цепи соматотропина человека выявлено 4a-спирали и 3 нерегулярных участка.

Соматотропин человека отличается от изученных соматотропинов животных на 34-35% (соматотропины животных неактивны при введении людям). [4]

Соматотропин вырабатывается и секретируется в кровь специализированными клетками, главным образом передней доли гипофиза-соматотрофами. Содержание соматотропина в гипофизе человека более чем на порядок превышает содержание других гормонов этой эндокринной железы. Для соматотропина характерен молекулярный полиморфизм, который обусловлен альтернативным слайсингом пре-мРНК или посттрансляционной модификацией (специфически ограниченный протеолиз, гликозилирование, фосфорилирование и др.). Продукт альтернативного сплайсинга пре-мРНК с молекулярной массой 20 тыс. выделен из гипофиза человека; у него отсутствует участок, занимающий положение 32-46 в молекуле  соматотропина. У женщин при беременности в результате экспрессии вариантного гена соматотропина продуцируется в плаценте молекулярная форма соматотропина, отличающаяся от обычного гормона в 15 положениях полипептидной цепи.

Действие соматотропина  на рост костей опосредовано через  соматомедины - инсулиноподобные ростовые факторы полипептидной природы.

Отдельные стороны биологические действия соматотропина могут в той или иной мере воспроизводиться фрагментами его полипептидной цепи. Фрагмент 31-44  соматотропина человека  проявляет характерное для гормона жиромобилизующее действие. Фрагмент 44-77 воспроизводит диабетогенное действие соматотропина, вызывая при введении животным нарушение обмена глюкозы. Фрагменты соматотропина различной видовой принадлежности 77-107, 96-133, 87-124 способны вызывать биологические эффекты гормона, связанные со стимуляцией ростовых процессов в организме. [5]

В 1920 г. появилась работа Эугена Штейнаха, посвященная омоложению. Штейнах изучал половую железу. Он предположил, что признаки старения обусловливаются теми частями половых желез, которые не отдают своих веществ наружу, а непосредственно направляют их в кровь и поэтому не служат продлению рода. Он полагал, что эта гормональная функция осуществляется определенной частью соединительной ткани яичек, которая и оказывает влияние на развитие вторичных половых признаков и на состояние молодости организма. В обширных опытах Штейнах показал действие гормонов этих желез. Штейнах является также инициатором изготовления эндокринных препаратов из соответствующих желез животных. По указанному им пути пошли многие исследователи в данной области.

Хотя гормон роста был  открыт в 20-х годах XX века, только в 1958 году эндокринолог из Новоанглийского медицинского центра в Бостоне Морис Рабен впервые ввел его ребенку, который не рос из-за того, что его тело не производило этого гормона. Это помогло. Ребенок начал расти. Существовал только один единственный источник получения гормона роста человека — мозг трупов. Для получения нескольких крошечных капель гормона, которые можно было бы инъецировать ребенку, требовались тысячи умерших. Но к 80-м годам, когда уже тысячи детей получали лечение этим гормоном на протяжении нескольких лет, стало ясно, что препарат, который обещал им нормальную жизнь, на самом деле отнимает у них шанс прожить ее. Болезнь Крейцфельдта-Джейкоба (БКД) — страшное заболевание, характеризуемое прогрессирующим слабоумием и потерей контроля над мышцами, которое обычно убивает свою жертву в течение пяти лет после первого проявления симптомов. Смертоносный вирус оказался в одной из порции гормона, который вводили детям. К 1991 году БКД развилась у семерых детей в группе из 5 тысяч реципиентов этого гормона, которые находились под наблюдением в США, а по всему миру насчитывалось пятьдесят случаев заболевания, связанных с инъекциями гормона, извлеченного из гипофиза трупов. Поскольку от мозга трупов как источника гормона пришлось отказаться, встал вопрос о получении синтетического гормона. Это была исключительно трудная задача.

Гормоны — это белки, а  белки строятся из аминокислот. Гормон роста — это крупнейший белок, производимый гипофизом и состоящий  из 191 аминокислоты.

Биосинтетический гормон, протропин, отличался от своего человеческого гормона роста одной аминокислотой. Эндокринолог  Дэниел Радмен выдвинул гипотезу, что процесс старения можно прервать используя СТГ. Он провел следующий эксперимент: пригласил 26 мужчин возрасте от 61 до 80 лет.

До конца эксперимента дошел двадцать один человек —  четверо отсеялись по личным причинам, а еще у одного был обнаружен  рак предстательной железы. Двенадцать человек получали инъекции СТГ три  раза в неделю, а девять составляли контрольную группу и никакого лечения  не получали.