Способы получения ДНК

                                                   Содержание

 

 

 

Введение

 

Нуклеиновые кислоты имеют первостепенное биологическое значение и представляют собой сложные высокомолекулярные биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды.

Они впервые были обнаружены в ядрах клеток, откуда и их название (нуклеус — ядро).

Существует два типа нуклеиновых кислот: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая.

Важные открытия были сделаны учеными, они открыли молекулу ДНК. На основе этой молекулы строится вся жизнь.

Немного из истории. ДНК впервые были открыты Мишером (F. Micscher, 1869), который назвал полученное вещество нуклеином (лат. nucleus ядро). Впоследствии было показано, что нуклеин представляет собой высокомолекулярную, содержащую фосфор кислоту, находящуюся в комплексе с белками, поэтому стали различать собственно нуклеиновую кислоту [Альтманн (R. Altmann), 1889] и ее комплексы с белками — нуклеопротеиды. Вскоре нуклеиновая кислота была получена из вилочковой железы (тимуса) теленка, оказавшейся богатым источником итого вещества. Вещество, близкое но свойствам, но отличающееся от нуклеиновой кислоты, полученной из тимуса, выделили из дрожжей. Выяснилось, что нуклеиновая кислота из дрожжей содержит аденин, гуанин, цитозин и урацил, тогда как нуклеиновая кислота. выделенная из тимуса теленка, вместо урацила содержит тимин. В качестве углеводного компонента в дрожжевой нуклеиновой кислоте нашли пентозу, а в препарате из тимуса — дезоксипентозу. В зависимости от источника получения эти нуклеиновые кислоты получили названия тимонуклеиновой и зимонуклеиновой. Поскольку первый тип нуклеиновой кислоты находили в животных объектах, а второй — в растительных, употребляли также названия «животная» и «растительная» нуклеиновые кислоты. Однако, когда Фейльген (R. Feulgen) разработал гистохимическую реакцию на «животную» нуклеиновую кислоту, оказалось, что она обнаруживается в ядре как животных, так и растительных клетоколо С другой стороны, «дрожжевая» нуклеиновая кислота была найдена Ж. Браше главным образом в цитоплазме клеток и растений, и животных. Наконец, А. Н. Белозерским наличие ДНК у растений было доказано химически. Названия «дезоксирибонуклеиновая кислота» (ДНК) и «рибонуклеиновая кислота» (РНК) были предложены после того, как Левином (Р.A. Levenе) было установлено, что дезоксипентоза в тимонуклеиновой кислоте является дезоксирибозой, а пентоза в зимонуклеиновой кислоте — рибозой.

 

1. Общие понятия о дезоксирибонуклеиновых  кислотах

 

Дезоксирибонуклейновые кислоты (ДНК; устаревшие названия: дезоксипентозонуклеиновые кислоты, ядерные нуклеиновые кислоты, тимонукленновые кислоты, животные нуклеиновые кислоты) — нуклеиновые кислоты, содержащие в качестве углеводного компонента дезоксприбозу, а в качестве одного из пиримидиновых оснований — тимин, которым в молекулах рибонуклеиновых кислот соответствуют рибоза и урацил. ДНК представляют собой линейные полимеры дезоксирибонуклеотидов, в последовательности азотистых оснований которых закодирована вся наследственная информация.

Таким образом, ДНК данного организма содержит в себе информацию о всех признаках вида и особенностях индивидуума — его генотип — и передает эту информацию потомству, воспроизводя определенную последовательность оснований в строении индивидуальных ДНК. Поскольку молекулы ДНК очень больших размеров и существует огромное множество возможных неодинаковых последовательностей из четырех различных нуклеотидов, число разных молекул ДНК практически бесконечно.

В природе ДНК содержатся во всех организмах за исключением РНК-содержащих вирусов. ДНК являются типичным компонентом клеточного ядра, в котором они находятся в комплексе с белками, главным образом гистонами, образуя дезоксприбонуклеопротеиды, составляющие основу цитологической структуры хроматина и вещества хромосом. ДНК обнаружена также в хлоропластах растительной клетки и в митохондриях животных и растений, в которых она кодирует часть белков этих структур, благодаря чему они обладают некоторой автономией и лишь частично зависят от ДНК ядра.

 

 

2. Способы получения  ДНК

 

Методика выделения ДНК зависит от состава и характера используемого источника (ткани животных или растений, микроорганизмы, вирусы). Для лабораторного и промышленного получения ДНК обычно используют вилочковую железу теленка, а также сперму (молоки) рыб, селезенку млекопитающих, ядерные эритроциты птиц.

Препараты ДНК,  получаемые обычно в виде натриевой соли ДНК, имеют вид белых волокон. Для сохранения нативных свойств ДНК обработку тканей и клеток проводят на холоду, по возможности быстро, в условиях, исключающих или уменьшающих действие дезоксирибонуклеаз, как правило, содержащихся в тканях и вызывающих ферментативный распад ДНК. Помимо сохранения нативных свойств, важнейшей задачей является очистка ДНК от других веществ, в первую очередь — от белков и РНК. В связи с этим методы получения ДНК различаются главным образом способами депротеинизации и очистки препаратов от примесей РНК. Для этих целей применяют обработку клеток и тканей различными детергентами, фенолами и другими депротеинизирующими агентами.

При получении ДНК из животных и растительных тканей чаще всего предварительно изолируют фракцию клеточных ядер или выделяют дезоксирибонуклеопротеиды, отмывая их солевыми растворами в физиологических концентрациях в присутствии ЭДТА или других соединений, связывающих двухвалентные катионы, необходимые для проявления ферментативной активности дезоксирибонуклеаз. После удаления основной массы белков препараты дополнительно депротеинизируют хлороформом с октанолом или фенолом. Нередко их обрабатывают также рибонуклеазами и протеолитическими ферментами, обычно проназой.

Для получения ДНК из бактерий обычно пользуются методом Мармура. который заключается в отмывании бактериальной массы 0,15 М Nad, содержащим 0,015 М цитрат натрия, лизисе клеток при 60° и рН 8,0 в 0,15 М NaCI, содержащем ЭДТА и 2% додецилсульфат натрия, депротепнизации их хлороформом, содержащим изоамиловый спирт, переосаждении спиртом, повторной многократной депротеинизации, обработке рибонуклеазой и осаждении изопропиловым спиртом. Этот метод в различных модификациях также успешно применяют для получения ДНК из животных и растительных тканей и изолированных клеточных структур, например, митохондрий.

 

 

 

 

 

 

 

3. Биологическая роль

 

Цитогенетические исследования в 20—30-х гг. 20 в. свидетельствовали о том, что передача и хранение наследственных признаков связаны с хромосомами, находящимися в ядерном веществе. То, что наследственным веществом является именно ДНК, а не белок, стало ясным в результате исследований, проведенных в 40-х гг. 20 в. на бактериях и бактериофагах (см. Ген).

В 1944 г. Эйвери, Мак-Лауд и Мак-Карти (О. Т. Avery, С. М. Мас-Leod, М. McCarty) установили природу трансформирующего фактора у бактерий. Им оказалась ДНК. Процесс трансформации состоит, несомненно, из ряда стадий: обратимой сорбции молекул ДНК бактериальной клеткой; внедрения этих молекул внутрь клетки; интеграции молекулы чужой ДНК в хромосому клетки, расщепления образовавшейся сложной структуры и ее перехода в рекомбинанты.

При исследовании бактериальных вирусов под электронным микроскопом пли при помощи радиоактивной метки, вводимой в белок или в ДНК бактериофага, было показано, что вирус, фиксируясь на поверхности бактериальной клетки, вводит в нее только молекулу ДНК, оставляя снаружи свою белковую оболочку. Молекула ДНК вируса, попавшая в клетку, несущая в себе всю наследственную информацию (геном) вируса, вызывает образование в клетке новых вирусных частиц, их размножение и гибель клетки от лизиса.

Некоторые, так называемые умеренные, фаги у части бактериальных клеток не вызывают явных признаков заражения, однако их ДНК, попадая в клетку, прочно связывается с геномом самой бактерии, интегрируясь с ДНК бактериальной клетки. Многие поколения таких бактерий несут в себе бактериофаг в скрытом виде, не проявляя признаков нарушения жизнедеятельности. Однако при неблагоприятных условиях и при действии каких-либо повреждающих факторов, например ионизирующей или ультрафиолетовой радиации, вирус в таких бактериях начинает размножаться и вызывает лизис (гибель) бактерий. ДНК вируса настолько прочно связывается с ДНК бактерий, что заражение вирусом, полученным от лизогенных бактерий, сопровождается переносом вместе с ДНК вируса части ДНК бактерий, с которой передаются некоторые наследственные свойства этих бактерий, отсутствующие и у вновь заражаемых бактерий, и у самого вируса. Это явление, сходное с трансформацией, получило название трансдукции .

Последовательность нуклоотидов в цепи ДНК переписывается в комплементарную ей последовательность нуклеотидов в молекуле РНК — так называемая транскрипция. Процесс этот осуществляется при участии фермента РНК-полимеразы. Генетическая информация, переписанная с ДНК на РНК, в конечном счете определяет первичную структуру (последовательность   аминокислотных остатков в строящейся молекуле белка). При помощи электронной микроскопии удалось увидеть рост цепей РНК на матрице ДНК, то есть работу гена на уровне транскрипции.

В процессе реализации или выражения генов имеет место кодирование генетической информации. Показано, что три последовательно расположенных нуклеотидных остатка (триплет) в цепи ДНК кодируют комплементарный триплет в цепи РНК, который в свою очередь контролирует включение одной, строго определенной аминокислоты в полипептидную цепь синтезирующегося белка. Установлено, что полипептидная цепь синтезируется колинеарно с ДНК, то есть в соответствии с линейным расположением триплетов ДНК. Известно, какие именно триплеты кодируют включение каждой аминокислоты.

Последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая образование определенной полипептидной цепи, представляет собой структурный ген, или цистрон. Изменение даже одной пары нуклеотидов в цистроне (точковая мутация) может привести к изменению структуры белка и потере им биологического активности. Такие точковые мутации могут представлять собой транзиции (замену пары нуклеотндов ГЦ на AT или наоборот), трансверсии (замена AT на ТА или ГЦ на Ц Г, то есть перемещение комплементарных оснований из одной цепи в другую), вставки пары нуклеотидов или их делецию (выпадение). Трансверсии и транзиции приводят обычно к замене одной аминокислоты в строящейся полипептидной цепи, тогда как вставки и делении вызывают изменение порядка считывания и приводят к глубокому нарушению структуры белка. Вставка же или делеция сразу трех пар нуклеотидов, то есть целого триплета, восстанавливает последовательность считывания, что и послужило одним из важнейших доказательств триплетности кода.

У высших организмов количество ДНК на геном достаточно для кодирования миллионов белков. В действительности число генов у человека и высших животных по крайней мере на порядок ниже и находится, по-видимому, между 10 000 и 100 000. Огромное количество избыточной ДНК, таким образом, не несет структурных генов и выполняет иные функции. Оказалось, что часть ДНК вообще не участвует в процессе транскрипции, а преобладающая часть РНК, синтезированной на матрице ДНК у высших организмов, претерпевает распад внутри клеточного ядра, не участвуя в синтезе клеточных белков. В связи с этим Г.П. Георгиевым была высказана гипотеза, согласно которой оперон (последовательность генов, контролирующих синтез ферментов, участвующих в катализе всех этапов одного и того же процесса) у высших организмов содержит большое число регуляторных генов, расположенных в начале считывания. Синтезирующаяся на таком опероне гигантская молекула РНК распадается в процессе ее переноса в цитоплазму, куда поступает только собственно информационная РНК, содержащая структурные гены и кодирующая синтез клеточных белков. Остальная часть этой РНК имеет регуляторные функции и распадается внутри ядра.

Особенностью высших организмов является также дифференцировка клеток и тканей. Гены, содержащиеся в ДНК каждой диплоидной клетки одного и того же организма (геном), качественно и количественно совершенно одинаковы, однако тот факт, что разные ткани и клетки резко различны по своему составу, строению и функциям, объясняется тем, что в них синтезируются неодинаковые белки. Таким образом, помимо регуляции активности действующих генов, при дифференцировке имеет место выключение или блокирование большей части генов, причем обычно активной остается небольшая часть генома, а в некоторых случаях синтезируется лишь один или несколько белков, например синтез гемоглобина в ретикулоцитах. Механизмы диффе-ронцпровкп во многом не ясны, однако показано, что белки, входящие в состав дезокснрибонуклеопро-теидов хроматина, оказывают выраженное действие на транскрипцию. Гистоны подавляют этот процесс, а кислые белки могут активировать его. Неактивные участки хроматина цитологически представляются более плотными, а в процессе транскрипции, напротив, хроматин выглядит более рыхлым и нити ДНК, по-видимому, частично отделяются от гистонов. Различными методами показано, что транскрипция ДНК происходит в разрыхленных участках хроматина, в так называемых пуфах, представляющих собой вздутие хромосом в области действующих генов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Доказательства генетической роли нуклеиновых кислот

 

1. 1928г. Опыты Фредерика Гриффита

 

Известно, что бактерия Pneutnococcus pneumoniae имеет несколько форм. Вирулентность бактерии определяется наличием мукополисахаридной капсулы, расположенной па поверхности клетки. Эта капсула защищает бактерию от воздействий со стороны организма-хозяина. В результате, размножившиеся бактерии убивают зараженное животное. Бактерии этого штамма (S-штамм) образуют гладкие колонии. Авирулентные формы бактерий не имеют защитной капсулы и образуют шероховатые колонии (R-штамм). Микробиолог Фредерик Гриффитс в 1928 году инъецировал мышам живого пневмококка R-штамма вместе с S-штаммом, убитым высокой температурой (65°С). Спустя некоторое время ему удалось выделить из заражённых мышей живых пневмококков, обладающих капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка - способность образовывать капсулу - перешло к живой бактерии, т.е. произошла трансформация. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма S перешла к клеткам штамма R.