Шпаргалка по дисциплине "Микробиология"

2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый  этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека.

76.Реакции иммунного лизиса; реакция гемолиза и бактериолиза, реакция локального гемолиза в геле Ерне, РСК.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лаковую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) ставится в две фазы: в первой фазе антиген соединяют с исследуемой сывороткой, в которой предполагают наличие антител, и добавляют комплемент, инкубируют в термостате 30 минут или 18-20 часов в холодильнике.

Вторая фаза: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате в течение 30 минут учитывают результат.

При положительной РСК антитела сыворотки, соединившись с антигеном, образуют иммунный комплекс, который присоединяет к себе комплемент, и гемолиза не произойдет. Если реакция отрицательная (антител в исследуемой сыворотке нет), комплемент останется свободным, и произойдет гемолиз.

РСК применяется для серологической диагностики сифилиса, гонореи, сыпного тифа и других заболеваний.

РСК можно применять и для определения антигена, например, вируса. В этом случае в качестве антител применяется диагностическая иммунная сыворотка.

В качестве комплемента для РСК применяется сыворотка крови морской свинки. Гемолитическую сыворотку получают из крови кроликов, иммунизированных эритроцитами барана.

77. Применение реакции иммунного ответа для диагностики вирусных заболеваний (реакция нейтралиациии вирусов, гемагглютинации, торможения гемагглютинации, гемадсорбции). ИФА, иммуноблоттинг.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином

В этой реакции антигеном является экзотоксин, антителами - антитоксины. При их взаимодействии происходит нейтрализация токсина. Реакцию ставят в пробирках для определения силы антитоксической сыворотки. Внешнее проявление реакции - флоккуляция (помутнение). Для обнаружения токсина с диагностической целью при ботулизме, столбняке, газовой анаэробной инфекции ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксином в биологическом опыте на животных.

РН вирусов. В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации - склеивание бактерий под влиянием специфических антител. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй - образование хлопьев в присутствии электролита (хлорида натрия). Видимая реакция происходит в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется антиген, и в результате образуется "решетка".

Методы постановки реакции агглютинации:

1) развернутая реакция агглютинации  ставится в пробирках с последовательными разведениями сыворотки;

2) реакция агглютинации на предметном  стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких  минут.

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют агглютинирующую сыворотку, полученную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыворотки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию.

Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, образуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, наступающая быстро - в течение двух часов.

Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает мелкозернистую агглютинацию в течение 18-24 часов.

Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации животных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специфичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом адсорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Полученные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела только к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С такими сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае является окончательной, а не ориентировочной.

Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так называемые диагностикумы. При постановке серологического диагноза учитывают диагностический титр сыворотки - для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Как и другие реакции иммунитета, ИФА используется 1) для определения неизвестного антигена с помощью известных антител или 2) для выявления антител в сыворотке крови больного с помощью известного антигена. Особенность реакции в том, что известный ингредиент реакции соединен с ферментом, и его присутствие определяется с помощью субстрата, который при действии фермента окрашивается.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА.

1) Обнаружение антигена (рис. 20). Первый этап - адсорбция специфических антител на твердой фазе, в качестве которой используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых панелей.

Второй этап - добавление исследуемого материала, в котором предполагается наличие антигена. Антиген связывается с антителами. После этого луночки промывают.

Третий этап - добавление специфической сыворотки, содержащей антитела против данного антигена, меченые ферментом. В качестве

фермента используют пероксидазу или щелочную фосфатазу. Меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале антигена на поверхности твердой фазы образуется комплекс антитело-антиген-антитела, меченные ферментом. Для обнаружения фермента добавляют субстрат. Для пероксидазы субстратом служит ортофенилдиамин в смеси с Н2О2 в буферном растворе. При действии фермента образуются продукты, имеющие коричневую окраску, интенсивность которой позволяет количественно определить результаты опыта фотометрированием.

2) Обнаружение антител (рис. 21). Первый  этап - адсорбция специфических антигенов на стенках лунки. Обычно в коммерческих системах антигены уже адсорбированы на поверхности твердой фазы - в лунках или на пластиковых шариках.

Второй этап - добавление исследуемой сыворотки. При наличии антител образуется комплекс антиген-антитела.

Третий этап - после отмывания лунок добавляют антиглобулиновые антитела (антитела против глобулинов человека), меченные ферментом.

Результаты реакции учитывают, как указано выше.

В качестве контролей используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Разрабатываются "безреагентные" системы для ИФА, в которых все компоненты реакции соединены с поверхностью полимера. Для проведения анализа необходимо внести исследуемый материал и наблюдать изменение окраски.

ИФА применяется при многих инфекционных заболеваниях, в частности, при ВИЧ-инфекции, при вирусных гепатитах.

Иммуноблоттинг - это вариант ИФА, сочетание электрофореза и ИФА. Методом электрофореза в геле, содержащем ферменты, разделяют биополимеры, например, антигены вируса иммунодефицита человека.

78. Патология иммунного ответа. Классификация по механизму нарушений иммунной системы. Иммунодефицитные состояния; первичные иммунодефициты, их генетические механизмы; вторичные иммунодефициты, причины возникновения; клинические проявления иммунодефицитов и принципы их лечения.

Иммунодефицитные состояния

Иммунодефицитами называют неполноценное функционирование иммунной системы. Иммунодефицитные состояния разделяют на первичные (врожденные) и вторичные (приобретенные).

Врожденные иммунодефициты связаны с генетическими дефектами развития иммунной системы. Дефекты В-снстемы ведут к пониженной выработке или полному отсутствию Ig-глобулинов. Чаще наблюдается избирательная недостаточность SIgA, что ведет к снижению местной защиты слизистых оболочек. Преимущественные дефекты Т-системы - это недоразвитие тимуса, которое обусловливает недостаточность клеточного иммунитета. Тяжелые последствия вызывают комбинированные дефекты Т- и В-системы. Наблюдаются также избирательные дефекты фагоцитов и дефекты системы комплемента.

Вторичные (приобретенные) иммунодефициты развиваются при многих бактериальных и вирусных инфекциях, при болезнях, сопровождающихся потерей белка (ожоги, болезни почек), при применении с лечебной целью рентгеновских лучей или иммуносупрессивных средств. Причинами развития вторичных иммунодефицитов могут быть диабет, ожирение, атеросклероз, истощение.

Приобретенные иммунодефициты инфекционной природы возникают вследствие размножения возбудителей непосредственно в клетках иммунной системы. Вирус иммунодефицита человека репродуцируется в Т-хелперах и макрофагах, и при этом страдают и клеточный, и гуморальный иммунитет, поскольку Т-хелперы являются регуляторами иммунного ответа.

Иммунодефицитные состояния способствуют возникновению инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, и развитию опухолей. Например, у больных СПИДом часто развивается саркома Капоши или пневмония, вызванная Pneumocysta carinii - микроскопическим грибом, который у людей с нормальным уровнем иммунитета не вызывает заболевания.

79. Понятие об аллергии, ее типы. Основные особенности и механизм формирования реакций гиперчувствительности немедленного типа; анафилактических, цитотоксических, болезней иммунных комплексов.

Термином "аллергия" (греч. allos - другой, ergon - действие) в настоящее время обозначают повышенную чувствительность организма к антигену (аллергену). Различают два типа аллергии: гиперчувствительность немедленного типа (ГЧНТ) и гиперчувствительность замедленного типа (ГЧЗТ).

Гиперчувствительность немедленного типа (ГЧНТ) связана с антителами, следовательно, зависит от В-лимфоцитов (В-зависимая аллергия). Аллергические реакции этого типа проявляются уже через 20-30 минут после повторной встречи с антигеном. К ГЧНТ относятся: анафилаксия, сывороточная болезнь, сенная лихорадка, бронхиальная астма, феномен Артюса и другие.

Анафилаксия (греч. ana - обратный, filaxis -защита). В основе анафилаксии лежит сенсибилизация, то есть образование антител в ответ на введение аллергена парентеральным путем. Явление анафилаксии наиболее четко демонстрируется на морских свинках. Подкожно морской свинке вводится сенсибилизирующая доза чужеродного белка -0,01-0,0001 мл лошадиной сыворотки. Через 10-14 дней в кровяное русло вводится разрешающая доза этого же белка в количестве 0,01-0,1 мл. Через 1-5 минут у морской свинки развивается анафилактический шок. Животное начинает беспокоиться, чешет лапками нос, чихает, шерсть взъерошена, появляется одышка, непроизвольное выделение мочи и кала, судороги. Через 5-10 минут в большинстве случаев свинка погибает.

Если выжившему после шока животному снова ввести тот же антиген, то реакции не развивается, так как наступило состояние десенсибилизации, сохраняющееся в течение 2-3 недель. Шок не возникает также и в том случае, если разрешающую дозу антигена ввести вскоре после сенсибилизации или вводить под наркозом.

Анафилактический шок может возникнуть у человека как осложнение при введении, чаще повторном, гетерологичной (чужеродной) лечебной сыворотки или антибиотиков. Сразу же после введения сыворотки или даже во время ее введения появляется беспокойство пациента, одышка, падение кровяного давления и температуры, потеря сознания. Бели не оказана немедленная медицинская помощь, наступает смерть.

Для предупреждения анафилактического шока иммунные гетеро-логичные (например, лошадиные) сыворотки вводят по способу, предложенному A.M. Безредка в 1907 г. Способ в настоящее время видоизменен и усовершенствован.