Шпаргалка по "Биологии"

14. Каталитический и контактный центры фермента? Может ли действовать фермент и почему, если разрушить контактный центр, каталитический центр?

Известно, что размеры ферментов намного превышают размеры субстратов или функциональных групп, на которые они действуют. Это дало основание предполагать, что субстрат соединяется не со всей молекулой фермента, а с отдельным его  участком, получившим название  “а к т и в н ы й  ц е н т р”, т.е. та область фермента, в которой происходит связывание и превращение субстрата.

Активный центр образуется радикалами аминокислотных остатков полипептидной цепи при формировании ее третичной структуры; у двухкопонентных ферментов в состав активного центра входят и некоторые группировки небелковой части. Достройка активного центра двухкомпонентных ферментов происходит после взаимодействия апофермента с небелковой частью. Нарушение третичной структуры фермента под влиянием различных факторов приводит к дефомации активного центра и изменению ферментативной активности.

Наиболее часто в состав активных центров ферментов входят радикалы серина, гистидина, треонина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Активный центр функционально неоднороден; в нем условно выделяют “каталитически активный” участок, где происходит превращение субстрата (расщепление или синтез связи), и так называемый контактный или “якорный” участок, который обеспечивает связывание субстрата с ферментом.

15. Что такое ген-регулятор и как он был обнаружен, механизмы его действия.

В бактериальном геноме существуют специальные регуляторные гены. Один из них - ген-регулятор (ген R), функция которого заключается в регуляции процесса транскрипции структурного гена (или генов). Ген- регулятор кодирует синтез специфического аллостерического белка- репрессора, имеющего два центра связывания: один узнает определенную последовательность нуклеотидов на участке ДНК, называемомоператором (ген О) , другой - взаимодействует с эффектором. Ген-оператор расположен рядом со структурным геном (генами) и служит местом связывания репрессора.

В отличие от операторных генов гены-регуляторы расположены на некотором расстоянии от структурных генов (продукты регуляторных генов - репрессоры являются свободно диффундирующими белковыми молекулами).

16. Что такое репрессор, индуктор? Механизмы индукции и репрессии, их отличительные признаки?

РЕПРЕССОР

(лат. repressor — ограничивающий, сдерживающий, от reprimo — подавляю, обуздываю), регуляторныйбелок, подавляющий транскрипцию генов регулируемого им оперона в результате связывания с оператором(регуляторным участком оперона). Это приводит к прекращению синтеза соотв. и РНК и, следовательно,ферментов, кодируемых опероном. Р. синтезируется под контролем гена-регулятора в кол-ве от 10 до 20молекул на клетку в виде активной, т. е. способной непосредственно связываться с оператором, илинеактивной форм. Образование активного Р. характерно для т. н. индуцибельных ферментов, синтез к-рыхначинается только при попадании в клетку специфич. низкомолекулярных веществ — индукторов.Связывание индуктора с Р. инактивирует Р. и тем самым открывает синтез соотв. ферментов (индукция). Длят. н. репрессибельных ферментов характерно образование неактивного Р. (апорепрессора), активация к-рого происходит при попадании в клетку низкомолекулярных веществ — корепрессоров. При этом синтезферментов, кодируемых опероном, прекращается (репрессия). Обычно индукторы и корепрессорыобозначают общим термином — эффекторы.

Теоретически регуляция синтеза ферментов могла бы осуществляться как при транскрипции, так и при трансляции. Как выяснилось, экспрессия генов у прокариот регулируется главным образом на уровне транскрипции. Большинство генов, кодирующих структуру полипептидных цепей, подвержено регуляции-точнее, регулируется их транскрипция. От условий среды и состояния клеточного метаболизма зависит, будут ли синтезироваться определенные ферменты, т.е. будут ли вообще и с какой частотой транскрибироваться соответствующие гены.

Для такой регуляции нужно, чтобы к ДНК из других частей клетки поступали определенные сигналы. Сигнальные вещества, или молекулы-эффекторы, представляют собой низкомолекулярные соединения, такие как сахара или их производные, аминокислоты или нуклеотиды. Поскольку такие эффекторы не могут вступать в прямое взаимодействие с ДНК, посредником для каждого из них служит определенный регуля-торный белок. Если эффектор присутствует в клетке в высокой концентрации, то в результате специфического присоединения к регуляторному белку он изменяет его кон формацию и тем самым-его способность связываться с ДНК. Регуляторный белок, который связывается с ДНК в отсутствие эффектора (индуктора), называют репрессором. Если же белок связывается с ДНК в присутствии эффектора (корепрессора), его называют апорепрессором.

Участки ДНК, к которым присоединяются регуляторные белки,-это не сами структурные гены, а непосредственно прилегающие к ним области, называемые промоторами и операторами. Промотор представляет собой последовательность оснований, распознаваемую ДНК-зависимой РНК-полимеразой; он служит местом связывания РНК-полимеразы, и от него начинается транскрипция. С промотором связаны и гены, экспрессия которых не подвержена регуляции. Промоторы регулируемых генов могут изменять свои свойства в результате связывания регуляторных белков. Оператор представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную между промотором и структурными генами. Он тоже взаимодействует с регуля-торным белком-репрессором, от которого зависит, будет ли подавлена транскрипция или она произойдет. Промотор, оператор и структурные гены образуют оперон. Опероном называют группу функционально связанных между собой генов. Белки, кодируемые генами одного оперона,-это, как правило, ферменты, катализирующие разные этапы одного метаболического пути. Транскрипция генов оперона ведет к синтезу одной общей (полицистронной) молекулы мРНК.

За синтез регуляторных белков ответственны гены-регуляторы, которые, вероятно, являются конститутивными. Они могут располагаться по соседству с соответствующим опероном, но это не обязательно.

По-видимому, РНК-полимераза способна правильно присоединяться к промотору только в форме полного голофермента. Она состоит из субъединиц а, р, р1, а и со. В отсутствие легко отделяющегося фактора сигма (а) фермент обладает полной каталитической активностью, но не способен связываться со специфическим участком ДНК - промотором. Этот фактор транскрипции (сигма) играет, вероятно, важную роль при специфическом присоединении полимеразы к ДНК.

За прекращение (терминацию) синтеза мРНК у конца оперона или отдельного гена, по-видимому, также ответственна специфическая область  ДНК - терминатор.   Какую   роль   играет   фактор   терминации  (р)-тетрамерный белок-при отделении РНК-полимеразы от ДНК, пока неясно.

Матричная РНК (мРНК) в отличие от тРНК и рРНК неустойчива и недолговечна; время ее полураспада составляет от 0,5 до 5 мин. Концентрация той или иной мРНК в клетке зависит только от частоты транскрипции соответствующего гена; и в свою очередь она определяет содержание в клетке ферментов, кодируемых этим геном.

Различают индуцибельные и репрессибельные опероны. Опероны, управляющие катаболизмом лактозы, галактозы и арабинозы, являются индуцибельными, т. е. максимальная частота их транскрипции достигается только тогда, когда в питательной среде присутствует внешний эффектор-лактоза, галактоза или арабиноза. Внешние эффекторы называют также внешними индукторами. Синтез ферментов индуцибельных оперонов включается посредствоминдукции. Наоборот, опероны, управляющие синтезом аргинина, гистидина или триптофана, являются ре-прессибельными, т.е. максимальная частота транскрипции достигается только при отсутствии в клетке соответствующих низкомолекулярных эффекторов-аргинина, гистидина и триптофана (или в том случае, если их концентрация ниже критического порогового уровня).

Такие эффекторы называют корепрессорами, а соответствующие ре-гуляторные белки - белками-репрессорами или апорепрессорами. Синтез ферментов репрессибельного оперона включается посредством дере-прессии.

Индукция лактозного оперона (отрицательный контроль). Лактозный оперон (/ас-оперон) Escherichia coliсодержит /ас-промотор, /ас-оператор и структурные гены для трех ферментов: $-галактозидазы, пермеазы итрансацетилазы (рис. 16.7). Этот оперон был тщательно исследован; удалось выделить его ДНК; была определена нуклеотидная последовательность области промотор-оператор; были выделены и исследованы регуляторные белки.

Оперон находится под отрицательным контролем, т.е. регуляторный белок (/ас-репрессор) остается связанным с оператором и препятствует транскрипции до тех пор, пока отсутствует индуктор. Внешним индуктором служит лактоза (а-В-галактозил-р-1,4-В-глюкоза). Она транспортируется с помощью пермеазы и превращается в аллолактозу (a-D-ra-лактозил-р-1,6-В-глюкозу), действующую как индуктор (внутренний). Катализатором этого превращения служит (3-галактозидаза. Оба фермента -пермеаза и (3-галактозидаза-присутствуют и в неиндуциро-ванных клетках, но в концентрациях, составляющих менее 0,001 от их концентраций после полной индукции. Связав аллолактозу, /ас-репрессор претерпевает конформационное изменение, уменьшающее его сродство к ДНК оператора, и в результате освобождает оперон для транскрипции.

Лактозный оперон подвержен также второму контролю - положительному. Это означает, что транскрипция происходит лишь тогда, когда с промотором связан второй регуляторный белок-САР, или CRP.

17. Что такое индуктор и корепрессор? Какова их роль в регуляции синтеза белка?

   Индуктор (inducer, inductor, evocator) [лат. inductor — возбудитель] — небольшая эффекторная молекула, связывающаяся с регуляторным (аллостерическим) белком, или физический фактор (свет, температура), которые стимулируют экспрессию генов, находящихся в неактивном состоянии.        

В эмбриологии, зачатки органов и тканей развивающегося зародыша, воздействие которых на другие,контактирующие с ними, части зародыша необходимо для развития последних в определённом направлении(см. Индукция). Например, у зародышей хордовых животных И. центральной нервной системы служит зачатокхорды и мышц (Хордомезодерма), И. линзы — зачаток глаза и т. д. Действие И. не имеет видовойспецифичности: И., взятый от зародышей одного вида животных, может вызвать индукцию соответствующегозачатка органа у зародышей другого вида. И. часто не теряют индуцирующих свойств после их умерщвления(фиксацией спиртом, кипячением и т. п.). В эксперименте действие собственных И. зародыша может бытьзаменено действием ряда органов и тканей (в живом или убитом состоянии) взрослых животных (чуждые илигетерогенные И.). Чуждые И. могут различаться по характеру индуцирующего действия; так, печень морскойсвинки вызывает у земноводных образование в эктодерме гаструлы (См. Гаструла) структур переднего мозга,а костный мозг — образование хорды, мышц и др. производных мезодермы (См. Мезодерма). Действие каксобственных, так и чуждых И. может осуществляться не только при непосредственном контакте их с клеткамиреагирующей системы, но и через фильтр с микроскопическими порами. Переход веществ из И. в клеткиреагирующей системы показан цито- и биохимическим, иммунологическим и др. методами. Переходящие изИ. в клетки реагирующей системы вещества локализуются в цитоплазме этих клеток. В ряде случаев из И.выделены вещества, обладающие разными индуцирующими свойствами: рибонуклеопротеид, вызывающийобразование головного мозга; белок с молекулярной массой 25—30 тыс., вызывающий образование хорды,мышц и др. производных мезодермы. Индуцирующее влияние сложных химических веществ, источникомкоторых служат И., может быть имитировано обработкой клеток реагирующей системы более простымихимическими соединениями, например сахарозой, хлористым литием, а также некоторыми повреждающимиагентами или изменением pH среды.

Корепрессор ( Corepressor) Небольшая молекула, связывающаяся с неактивным репрессором ( апорепрессо-ром) с образованием комплекса, присоединяющегося к оператору и блокирующего транскрипцию. 

Молекулы корепрессора и ре-прессора присоединяются к гену-оператору и подавляют его активность. Структурные гены выключаются, мРНК не образуется и синтез триптофансинтазы прекращается. 

Апорепрессоры и корепрессоры строго специфичны: аргинин не тормозит синтеза других аминокислот, он соединяется только со своим апорепрессором; последний же действует только на аргининовый оперон и ни на что другое.Если молекула какого-либо корепрессора связывается своим активным участком с молекулой репрессора, то она усиливает эффект от связывания репрессора с геном-оператором. При этом происходит инактивация гена-оператора, что фактически препятствует включению структурных генов. Такие эффекторы называют корепрессорами, а соответствующие ре-гуляторные белки - белками-репрессорами или апо реп рессорами. Синтез ферментов репрессибельного оперона включается посредством дере-прессии.Конечные продукты реакции ( их называют корепрессоры) повышают сродство репрессора к гену-оператору.Угнетение начала цепи конечным продуктом происходит и в системах синтеза ферментов, когда продукт ферментативной реакции является корепрессором оперона, синтезирующего данный фермент. Однако он действует на Ф, - первый фермент в цепи - прямо, а не в качестве корепрессора. Конечный продукт непосредственно связывается с Ф4 и инактивирует его.Из него видно, что ген-регулятор образует апорепрессор, превращающийся в репрессор только после связи с конечным продуктом реакций - корепрессором. Только в таком связанном виде репрессор блокирует ген-оператор и прекращает синтез фермента. 

18. Механизмы регуляции синтеза белка?

Основным условием существования любых живых организмов является наличие тонкой, гибкой, согласованно действующей системы регуляции, в которой все элементы тесно связаны друг с другом. В белковом синтезе не только количественный и качественный состав белков, но и время синтеза имеют большое значение. От этого зависит приспособление микроорганизмов к условиям окружающей питательной среды как биологической необходимости или приспособление сложного многоклеточного организма к физиологическим потребностям при изменении внутренних и внешних условий. Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не синтезируют все белки. Количество и разнообразие белков, в частности ферментов, определяются степенью их участия в метаболизме. Более того, интенсивность обмена регулируется скоростью синтеза белка и параллельно контролируется аллостерическим путем (см. главу 4). Таким образом, синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций. Все это свидетельствует о весьма сложном, тонком и целесообразном механизме регуляции синтеза белка в клетке. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизмы регуляции синтеза белка, вероятнее всего, являются более сложными (см. далее). У бактерий доказана индукция ферментов (синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления – индукция и репрессия – взаимосвязаны. 
Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано, служит матрицей для биосинтеза белка. 
Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т.е. формирование мРНК, начинается с промотора – участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, принято называть полигенным (полицистронным) транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон. В свою очередь деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрес-сора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе (рис. 14.13). Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать (запрещать) деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который, таким образом, выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Процесс этот аналогичен взаимоотношениям алло-стерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом. 
Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах с Е. coli на примере синтеза β-галактозидазы (лактазы) – фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е. coli обычно растет на глюкозе. Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синтезировать β-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а следовательно, синтез β-галактозидазы в рибосомах.