Революционные направления в генной инженерии, геномике и протеомике, новейшие достижения молекулярной биотехнологии

Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом  клонирования. Метод дает возможность  получения большого числа копий  животных  от  высокоценных  производителей.  Возможно  получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки  яйцеклеток  свиньи,  помещают  в агаровые  цилиндры  на  несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец. Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок – ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.

Манипуляции на эмбрионах  используют для получения эмбрионов  различных животных. Подход позволяет  преодолеть межвидовой барьер и создавать  химерных  животных.  Таким  образом  получены,  например,  овцекозлиные  химеры.  Первые  эксперименты  показали  возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока.

Новый метод – перенос  ядра соматической клетки (или перепрограммирование яйцеклеток) начинается с выделения  из организма соматической клетки –  любой клетки, не участвующей в  процессе репродукции (т.е. любой, кроме  половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток).

Для создания овцы Долли  исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой  было предварительно  удалено.  После  проведения  определенных  химических  манипуляций яйцеклетка с подмененным  ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности.  Появление Долли продемонстрировало  возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку. 

В  течение  5-6  дней  яйцеклетка  развивается  в  эмбрион,  генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы  для  получения  любого  типа  ткани,  которая  при  пересадке  не  будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть использован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время.  Совершенствование  биотехнологических  методов  и  средств  диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений – все это способствует повышению качества жизни человека. 

2. Геномика и ее главные достижения

Во второй половине XX в. бурно развивались аналитические  методы биохимии, молекулярной биологии и вычислительной техники. Выдающиеся успехи, достигнутые в этих областях, привели к возможности расшифровки  огромных последовательностей оснований  нуклеиновых кислот и к записи полного генома живого организма. Впервые  полный геном был расшифрован в 1980 г. у бактериофага phi Х-174 (около 5•103 оснований), затем у первой бактерии – Haemophilus influenzae (1, 8•106 оснований). А c завершением XX в. была закончена грандиозная работа по расшифровке полного генома человека – выявлению последовательности примерно 3 млрд оснований нуклеиновых кислот. На эту работу было затрачено несколько миллиардов долларов (примерно по одному доллару на одно основание). Всего же уже расшифрованы геномы нескольких десятков видов живых организмов. Именно в этот период возникла новые биологическая наука: в 1987 г. впервые в научной печати было использовано слово «геномика».

Геномика – это направление биотехнологии, занимающееся изучением геномов и ролей, которые играют различные гены, индивидуально и в комплексе, в определении структуры, направлении роста и развития и регуляции биологических функций. Различают структурную и функциональную геномику. 

Рис. 1. Взаимосвязь геномики, протеомики и биоинформатики при решении проблемы конструирования новых лекарственных средств

 

2.1 Структурная и функциональная геномика

Предмет структурной геномики – создание и сравнение различных типов  геномных  карт  и  крупномасштабное  секвенирование  ДНК.  Проект  по изучению человеческого генома (Human Genome Project) и менее известная Программа по  изучению  растительных  геномов (Plant  Genome  Research Program)  являются  самыми  масштабными исследованиями  структурной  геномики. В задачи структурной геномики входят также идентификация, локализация и составление характеристик генов. В результате осуществления частных и государственных проектов по структурной геномике созданы карты геномов и расшифрованы последовательности ДНК большого количества организмов, в том числе сельскохозяйственных растений, болезнетворных бактерий и вирусов, дрожжей, необходимых для приготовления некоторых продуктов питания и производства пива, азотфиксирующих бактерий, малярийного плазмодия и переносящих его комаров, а также микроорганизмов, используемых  человеком  в  самых  разнообразных  промышленных  процессах.    

В 2003 г. завершен Проект по изучению генома человека. 

Предмет  и  область  функциональной  геномики  – секвенирование  геномов, идентификация и картирование генов, выявление функций генов и механизмов регуляции. Для понимания различий между видами основную роль играет не знание количества генов, а понимание того, как они различаются по составу и функциям, знание химических и структурных различий в генах, которые и лежат в основе различий организмов. Эволюционный анализ постепенно становится главным приемом выяснения функций и взаимодействий генов в пределах генома.

Еще одно важное направление  функциональной геномики — траискриптомика — изучает координированную работу генов, образование первичных транскриптов, процессы сплайсинга и формирования зрелых мРНК. Благодаря технологии микрочипов удается одновременно анализировать картину транскрипции мРНК со ста тысяч генов. Исследование «транскриптома» этим методом позволяет установить различия между экспрессией генов в разных тканях, проанализировать характер экспрессии в разные периоды болезни, а также классифицировать белки - на секретируемые и связанные с мембранами (определяя положение их мРНК.

Технологии, позволяющие  анализировать молекулярные механизмы  путем сравнения генов или  их продуктов в разных органах  и тканях, а также геномов различных  организмов, развиваются в рамках сравнительной геномики. Так, сравнения белковых последовательностей внутри и между видами организмов помогают получить информацию об их потенциальных функциях. Однако при неудаче простого сравнительного анализа, основанного на гомологии с другими белками и/или на их трехмерном строении, определяют разные компоненты белковых комплексов и/или клеточных структур перед тем, как их истинная функция станет очевидной. Изучение координации внутри клетки и организма действия пакетов генов путем сравнения геномов разных видов основано на том, что жизненно важные регуляторные функции сохранились у многих видов организмов на протяжении эволюции. Например, информация о регуляции клеточного цикла, необходимая для понимания процесса канцерогенеза у человека, была получена путем сравнения с аналогичными процессами у дрожжей

Избирательная инактивация у мышей позволила определить функции многих эффекторов иммунной системы и регуляторов ранних стадий кроветворения.

 

 

2.2 Достижения и потенциал геномики. Генотерапия

Благодаря тому, что генетический код универсален и все живые организмы  способны  расшифровывать  генетическую  информацию  других организмов  и  осуществлять  заложенные  в  ней  биологические  функции,  любой ген, идентифицированный в ходе того или иного геномного проекта, может быть использован в широком спектре практических приложений:

– для целенаправленного  изменения свойств растений и придания им желаемых признаков;

– выделения специфических  рекомбинантных молекул или микроорганизмов;  

– идентификации генов, участвующих в осуществлении сложных процессов, контролируемых множеством генов, а также зависящих от влияния окружающей среды;

– обнаружения микробных  заражений клеточных культур.

– для создания лекарств, направленных на специфические мишени, блокирующие работу генов патогенности

Практическое приложение сведений о нуклеотидной последовательности геномов многих патогенных вирусов  уже широко реализуется. Генно-инженерным путем создаются непатогенные фрагменты  геномов вирусов. Такие фрагменты  способны к экспрессии в высоких  концентрациях белков вирусов, которые необходимы для приготовления диагностических и вакцинальных препаратов. Развивается технология приготовления ДНК-вакцин против СПИДа, гепатита С и других вирусных инфекций.

Сравнивая гены, ученые смогут выявить связи разных генетических вариаций и мутаций со всевозможными  заболеваниями.

Прогресс в изучении генома привел к возникновению такого важного практического приложения геномики к медицине, как генотерапия. Она поможет бороться с такими заболеваниями, как муковисцедоз, фибродисплазия, гемофилия А, комбинированный иммунодефицит и др.

При генотерапии требуются предварительное создание рекомбинантной генетической конструкции с нормальной "здоровой" копией дефектного гена, а также создание для этой конструкции вектора, переносящего ее в клетки организма.

Методы введения генов  в клетки-мишени при генотерапии весьма разнообразны, но в большинстве случаев недостаточно эффективны. Это связано с встраиванием чужеродной ДНК в геном только небольшого процента клеток ткани, а также с разрушением ее нуклеазами и т.д. Обнадеживающие результаты получены при использовании генов, "упакованных" в липосомы.

В настоящее время наиболее перспективным путем переноса генов  при генотерапии является включение их в векторы, построенные на основе ретро- или аденовирусов. Конечно, здесь прежде всего возникает вопрос о безопасности подобных векторов. Вирусы генетически модифицируются так, чтобы при сохранении способности проникать в клетку они теряли бы способность к автономной репликации.

В перспективе планируется  проводить генотерапию с помощью целых рекомбинантных хромосом, что позволяет оперировать рядом генов и их регуляторных последовательностей одновременно.

Современная генотерапия направлена только на соматические, а не на половые (зародышевые) клетки.

Генотерапия ех vivo (вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Исправленные клетки наращиваются и вводятся пациенту трансфузией или трансплантацией.

При генотерапии in vivo доставка нормального гена осуществляется непосредственно в ткани человека (в клетки определенных тканей)

 

 

 

 

 

3. Протеомика - белковая инженерия

3.1 Основные задачи протеомики

Протеомика – это наука, занимающаяся  изучением структуры, функций, локализации и взаимодействия белков внутри клетки и между клетками.

Набор белков клетки называется ее протеомом. По сравнению с геномикой, протеомика ставит перед исследователями гораздо более многочисленные и трудные задачи. Структура белковых молекул гораздо сложнее, чем структура молекул ДНК, которые представляют собой линейные молекулы, состоящие из четырех нерегулярно повторяющихся элементов (нуклеотидов). Форма,  которую  принимает  белковая  молекула,  зависит  от  последовательности аминокислот, однако все механизмы скручивания и складывания аминокислотной цепочки до конца не изучены. Задачей исследователей, работавших над программой Human Genome Project, была разработка методов, которые позволили бы добиться поставленных целей. Ученые, занимающиеся протеомикой, и сейчас находятся в подобном положении: им необходимо разработать достаточное количество методов и приемов, которые могли бы обеспечить эффективную работу над огромным количеством вопросов:

– каталогизацию всех белков, синтезируемых различными типами клеток;

– выяснение характера  влияния возраста, условий окружающей среды и заболеваний на синтезируемые клеткой протеины;

– выяснение функций  идентифицированных белков;

– изучение взаимодействий различных белков с другими белками внутри клетки и во внеклеточном пространстве.

 

2. Изучение структуры и функционирования протеома

Чтобы получить сведения о  протеоме, необходимо сначала его выделить и очистить от других молекул. Поскольку число белков во всем протеоме (т.е. во всем организме) весьма велико, обычно берут только часть организма (его орган или ткань) и различными методами выделяют белковую компоненту. За почти 200-летнюю историю изучения белков разработано множество методов выделения белков – от простого солевого осаждения до современных сложных методов, учитывающих различные физические и химические свойства этих веществ. После получения чистой фракции индивидуального белка определяется его химическая структура.

В структурной протеомике проводится определение структуры не одного, а сразу множества белков, и к настоящему времени для этого разработан специальный цикл процедур и создан арсенал соответствующих высокоточных приборов. (Полный набор оборудования для протеомных исследований стоит более одного миллиона долларов.)

Рис. 2. Инструменты протеомики

На рис. 2 приведена схема  лабораторного цикла от приготовления  образца до определения его структуры. После выделения и очистки (на рисунке представлен уже выделенный и очищенный препарат) с помощью  двумерного электрофореза проводится разделение белков. Это разделение идет по двум направлениям: в одном  разделяются молекулы белка, имеющие  разную массу, в другом – различный  суммарный электрический заряд. В результате этой тончайшей процедуры  на специальном носителе одинаковые молекулы группируются, образуя макроскопические пятна, причем в каждом пятне содержатся только одинаковые молекулы. Число  пятен, т.е. число разных белков или  пептидов, может составлять многие тысячи (рис. 3, 4), и для их исследования используются автоматические устройства для обработки и анализа. Затем  проводится отбор пятен и введение содержащихся в них веществ в сложнейший физический прибор – масс-спектрометр, с помощью которого и определяется химическая (первичная) структура каждого белка.