Продуценти антибіотиків

Для цього необхідно:

а) впровадження у виробництво  найбільш високопродуктивних штамів мікроорганізмів-продуцентів  антибіотиків;

б) створення й забезпечення найсприятливіших умов розвитку продуцента антибіотика на відносно дешевих  середовищах;

в) широке використання математичних методів планування процесу розвитку організму й електронно-обчислювальної техніки з метою оптимізації й моделювання умов його культивування, що забезпечують максимальний вихід антибіотика;

г) застосування сучасного  обладнання на всіх стадіях технологічного процесу з автоматизованими системами, що контролюють основні параметри  розвитку організму і стадій біосинтезу антибіотика.

Біотехнологічний процес одержання антибіотиків можна зобразити  у вигляді наступної схеми (мал.1) [2].

 

 

Мал. 1. Схема виробництва  антибіотиків в процесі мікробіологічного  синтезу.

 

3. ПРОДУЦЕНТИ АНТИБІОТИКІВ

 

У 1943 р. З.Ваксман виділив  з актиноміцетів високоактивний антибіотик стрептоміцин, який виявився дуже цінним для лікування туберкульозу. Російські вчені Г.Ф.Гаузе, З.В.Єрмольєва, М.О.Красильников та інші відкрили антибіотики граміцидин С, альбоміцин, бацитрацин, екмолін тощо. Продуцентами антибіотиків є бактерії (граміцидин, бацитрацин, едеїн, тиротрицин, субтилін та інші), актиноміцети (стрептоміцин, тетрацикліни, мономіцин, левоміцетин, ністатин тощо), гриби (пеніцилін, цефалоспорини, грізео-фульвін, мікроцид, фумагілін та інші). Продуцентом останнього є плісневий гриб Aspergillus fumigatus. Інший представник роду Aspergillus — A. flavus — синтезує аспергілову і оксіаспергілову кислоти, які володіють широким спектром антимікробної дії. За даними В.В.Смірнової та співавторів (2000), бацили (B.subtilis і B.polymyxa) є продуцентами пептидних антибіотиків — мерсацидину, кристеніну, гавасерину, поліміксину та ін. Виявлено також, що A. flavus є продуцентом афлотоксинів. До антибіотиків тваринного походження належать: лізоцим, еритрин, інтерферони тощо. Серед антибіотиків рослинного походження найпоширенішими є аліцин, аренарин, берберин, іманін, рафанін.

Процес отримання антибіотика  включає в себе чотири основні  стадії: отримання відповідного штаму - продуцента антибіотика, придатного для промислового виробництва; біосинтез  антибіотика; виділення і очищення антибіотика; концентрування, стабілізація антибіотика та отримання готового продукту. 

В даний час культивування  штамів-продуцентів відкриває все  нові можливості для отримання широкого кола біологічно активних сполук, в  тому чiслi i антибіотиків. У зв'язку з цим перспективні біотехнологічні  процеси, в яких для зростання  ефективностi використовують стійкі штами  продуценти. Зростаюча роль застосування антибіотиків у медицині висуває важливе завдання пошуку зручних та економічних продуцентів. 

 

3.1. Отримання продуцентів антибіотичних речовин

 

Перше завдання при пошуку продуцентів антибіотиків - виділення  їх з природних джерел. Разом з  тим для цих цілей широко застосовується метод зміни геному виділеного продуцента антибіотика шляхом мутагенезу та генної інженерії.

В основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено  принцип виділення чистої культури мікроба і безпосереднього випробування його по відношенню до використовуваних тест-організмів. Більшість сапрофітних  бактерій добре розвивається на багатих  за складом натуральних середовищах (м’ясопептонний агар, картопляний  агар, сусло-агар та ін.) при рН близько 7,0 і температурі 30-37°C.

У цих же умовах розвиваються актиноміцети і деякі гриби, але  для них вони менш сприятливі, ніж  для бактерій. Актиноміцети ростуть  повільніше, ніж бактерії, вони можуть використовувати такі джерела живлення, які не дуже добре засвоюються  бактеріями. Значення рН середовища після  стерилізації встановлюється в межах 6,8-7,1.

Міцеліальні гриби краще  розвиваються на середовищах з дещо зниженим значенням рН (4,5-5,0), на яких погано ростуть багато бактерії і  актиноміцети.

Технологічний процес виробництва  антибіотиків починається зі стадії біосинтезу антибіотичниx речовин в  умовах глибинного культивування продуцента - мікроорганізму (ферментера) в спеціально підібраною поживному середовищі при  строго контрольованiй температурі  та інтенсивнiй аерації зі збереженням  повної стерильності під час всього процесу ферментації. Якість антибіотиків, що отримуються в результаті промислового виробництва, значною мірою залежить від рівня біосинтетичнoї активності штаму-продуцента. У промисловості використовують тільки високопродуктивні штами мікроорганізмів, вирощені в процесі тривалої селекційної роботи.

Тривалість вирощування  штаму-продуцента коливається від 48 годин до кількох діб. Після завершення процесу культивування продуцента культуральну рідину піддають спеціальній  обробці і наступнiй фільтрації (відокремлення від біомаси продуцента). Потім в залежності від властивостей антибіотика і його хімічної будови застосовують різні методи виділення  і очищення. В якості основних методів  використовують екстракцію, осадження, сорбцію на іонообмінних матеріалах, упарювання і сушку. Таблиця 1

Склад поживних середовищ, рекомендованих для виділення актиноміцетів

Сeреда 1		Сeреда 2		Сeреда 3
Компоненти	Кiлькiсть	Компоненти	Кiлькiсть	Компоненти	Кiлькiсть
SO4	1	KNO3	1	NaCl	5
K2HPO4	1	K2HPO4	3	CaCl2	0,5
NaCl	1	NaCl	0,2	Пептон	5
MgSO4	1	MgCO3	0,3	Кукурузний eкстракт	5 мл
Крохмаль	10	FeSO4	0,001	Глюкоза	10
Агар-агар	15	CaCO3	0,5	Агар-агар	15
Вода	1000	Крохмаль	10	Вода	1000
		Агар-агар	15
		Вода	1000

 

 

Завершальна стадія виробництва  антибіотиків - отримання готової  продукції: виготовлення лікарської форми, пакування та маркування із зазначенням  терміну придатності препарату  і змісту активної речовини.    

Очищені препарати для  парентерального застосування випускають у вигляді стерильно розфасованого  у флакони сухого порошку, розчинногo у воді або спеціальному розчиннику, антибіотиків у флаконах та у вигляді  готових до введення розчинів.

Для використання усередину  випускають препарати у вигляді  порошку, спеціальних таблеток (брикетів) і рідше - у формі розчинів. Для  лікування гінекологічних захворювань  організовано виробництво супозиторіїв, брикетів, водно-масляних емульсій та інших лікарських форм. 

 

Таблиця 2

Склад поживних середовищ, рекомендованих

для виділення міцеліальних грибів

Сeреда 1		Сeреда 2
Компоненти	Масова доля, %	Компоненти	Масова доля, %
Глюкоза	2	Глюкоза	1
Сахароза	2	Сахароза	1
Кукурузний экстракт (СВ)	0,1	Перевар Хоттингера	4
NH4NO3	0,02	K2HPO4	0,05
K2HPO4	0,1	MgSO4 × 7H2O	0,05
MgSO4 × 7H2O	0,05	ZnSO4	0,001
ZnSO4	0,01	FeSO4	0,001
FeSO4	0,001

 

  

 

3.2. Вплив умов культивування

 

До числа найбільш істотних факторів, які впливають на прояв  антибіотичних властивостей мікроорганізмів, відносяться склад середовища, її активна кислотність, окислювально-відновлювальні умови, температура культивування, методи спільного вирощування двох або більшої кількості мікроорганізмів і інші фактори.  

 

3.2.1. Середовища для культивування мікроорганізмів

Натуральні (комплексні) середовища, що складаються з природних сполук і мають невизначений хімічний склад (частини зелених рослин, тваринні тканини, солод, дріжджі, фрукти, овочі, гній, грунт і т. д.), містять всі  компоненти, необхідні для росту  і розвитку мікроорганізмів більшості видів. Використовуються такі середовища:

• м’ясопептонна середa, до складу якої з м'ясним екстрактом і пептонiв входять хлорид натрію, фосфат калію, іноді глюкоза або  сахароза;

• картопляні середовища з  глюкозою і пептони, що використовуються в лабораторії для культивування  багатьох видів актиноміцетів і  бактерій;  
• середовища з кукурудзяним екстрактом, соєвим борошном та іншими речовинами, до складу яких входять сульфат амонію, карбонат кальцію, фосфати, глюкоза, сахароза, лактоза або інші вуглеводи і ряд інших сполук; середовища успішно застосовуються в промисловості, тому що є дешевими і забезпечують розвиток мікроорганізмів з високим виходом антибіотиків.

Оскільки натуральні середовища не дозволяють отримувати суворі кількісні  дані для вивчення фізіологічних  і біохімічних особливостей організму, застосовують синтетичні середовища, які підбирають для окремих продуцентів  індивідуально. Синтетичні середовища можуть бути,як відносно простими, так  і складними, для складання яких використовують методи математичного  планування експерименту. Джерелами вуглецю можуть бути органічні кислоти, спирти, вуглеводи, поєднання різних сполук.

Таблиця 3

Вплив джерела вуглецю  на зростання B. brevis subsp. G.B.  
і біосинтез граміцидину (48 год культивування)

Джерело вуглецю	Антибiотик, мкг/мл	Бiомаса, мг/100 мл
Глюкоза	300	220
Галактоза	250	300
Мальтоза	250	250
Сахароза	0	140
Лактоза	0	160
Крохмаль	250	160
Глицерин	1000	460
Маннит	0	100
Этанол	0	12
Янтарна кислота	350	180
Пiровиноградна кислота	0	95
Уксусна кислота	25	80
Молочна кислота	250	160

 

 

При промисловому отриманні  ряду антибіотиків, як джерела вуглецю  нерідко застосовують картопляний  крохмаль, кукурудзяне борошно або  інші рослинні матеріали . Однак не всі продуценти мають досить активнi амілази, якi здатнi здійснювати гідроліз крoхмаловмiстивої сировини. Попереднє оцукрювання крoхмаловмiстивиx матеріалів за допомогою ферментів значно полегшує використання мікроорганізмами цих матеріалів. Джерела азоту дуже впливають на формування мікроорганізмами антибіотичних речовин. Зазвичай в середовищах для культивування мікроорганізмів джерелом азоту служать солі азотної (рідше азотистої) кислоти, амонійні солі органічних та неорганічних кислот, амінокислоти, білки і продукти їх гідролізу.

Багато мікроорганізмів  успішно використовують і окислені форми азоту, деякі з них потребують саме нітратного джерелa азоту (Streptomyces auranticus, S. subtropicus і деякі інші). Ряд  актиноміцетів іноді засвоюють  краще нітрати, ніж амонійні солі; вони можуть використовувати навіть нітрити, якщо їх вносять у середу в невеликих кількостях (не більше 50 мг NaNO2/1л середовища). При цьому засвоєння нітритів тісно пов'язане з джерелом вуглецю; наприклад у присутності гліцерину нітрити споживаються набагато краще, ніж в присутності глюкози. Використання амонію та деяких органічних джерел азоту цвілевими грибами поліпшується у присутності невеликих кількостей (0,1-0,2%) деяких дикарбонових (янтарної і фумарової) кислот. У ряді випадків для накопичення антибіотика необхідна присутність і амонійного, нітратного і джерела азоту (біосинтез пеніциліну). Зазвичай найбільш сприятливим для мікроорганізмів є співвідношення C:N=20. Однак для формування антибіотика таке співвідношення не завжди оптимально. Тому для кожного продуцента необхідно підбирати відповідне співвідношення вуглецю та азоту. Джерелами мінерального живлення служать фосфор, сірка та інші макро-та мікроелементи. Більшість мікроорганізмів легко використовують, як джерела фосфору ортофосфати. Окремі види поряд з цим споживають і фітати (солі інозітфосфорних кислот). Продуценти антибіотиків по відношенню до концентрації фосфору в середовищі можна розділити на три групи:

• високочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору  в середовищі становить менше 0,01% (продуценти нистатина, тетрацикліну, флоріміціна, ванкоміцину);

• продуценти середньої  чутливості, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,010-0,015% (продуценти стрептоміцину, еритроміцину, циклосерином, неоміцину);

• малочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору  становить 0,018-0,020% (продуценти новобіоціна, граміцидину, олеандоміцин).