Получение трансгенных растений

Генетические изменения  сельскохозяйственных культур позволяют  существенно улучшить их агротехнические  и  пищевые показатели. Главной целью биотехнологии растений за последние годы является оптимизация технологий получения культур с улучшенными свойствами. Одна из этих целей – вырезание из генома растений последовательностей, подобных генам устойчивости, которые нужны только в процессе трансформирования растений.

Трансформация растеий основывается на введении в их геном чужеродной ДНК, и эффективности регенерации трансформированных клеток в побеги или зародыши. Однако, низкая эффективность трансформации многих культур вынуждает использовать селективные гены для идентификации трансгенных растений. В качестве селективных генов берут гены, обеспечивающие устойчивость растений к антибиотикам и гербицидам. Таким образом, можно отличить единичные трансгенные клетки среди большого числа нетрансформированных.

Однако общественность выражала негативное отношение к использованию  растений с наличием таких генов, ссылаясь на возможное непредсказуемое  влияние их на экосистему и здоровье человека. Устойчивость к гербицидов может передаться спонтанным скрещиванием в близкородственные сорные растения. А гены, придающие устойчивость к антибиотикам, теоретически могут передаться болезнетворным бактериям человека, хотя данная теория еще не подтверждалась фактически. И вырезание генов, придающих устойчивость к антибиотикам и гербицидам, могло бы способствовать принятие трансгенных растений общественностью, и их коммерческой реализации.

 Замена селективных генов репортерными генами.

В отличие от систем, где  происходит отбор трансгенных клеток под действием антибиотиков и гербицидов, такие гены придают модифицированным растениям изменения в метаболизме. Это позволяет также увеличить эффективность регенерации трансформированных растений. К таким генам относятся гены бактерий β-глюкоринидаза, ксилоза изомераза, фосфороманноза изомераза, а так же дрожжевой ген 2-дезоксиглюкозо-6-фосфатная фосфатаза. Также применяется ген, который кодирует фермент, играющий роль в метаболизме фитогормонов – изопентилтрансфераза (ipt), выделенный из Т-ДНК Agrobacterium, успешно применяется в отборе трансгенных растений. Гены A, B, C, увеличивающие чувствительность трансгенных клеток к гормонам, позволяют визуально отличить такие клетки от остальных «волосатыми» корнями. Также существует другие репортерные системы, позволяющие проводить отбор трансгенных растений. И использование таких генов позволяет уменьшить распространение генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам в окружающей среде. Однако, так как размер конструкции для проведения трансформации должен быть минимально коротким, вырезание генов, используемых для отбора трансгенов, является более предпочтительным.

Элеминация маркерных генов котрансформацией.

Одним из способов отделения  селективного гена от целевого является их разделение на стадии трансформации. Для проведения такой трансформации  исползуют Agrobacterium, так как введение элементов трансформации раздельно требует больше регуляторных элементов, чем при прямом введение чужеродной ДНК в растительный организм.

Сайт-специфическая трансформация.

Возможность бактериальных  рекомбиназ разрезать ДНК в специфических сайтах и сшивать разрезанную ДНК, позволило широко их использовать в различных манипуляциях с геномом эукариотов. И первая работа, показавшая возможность вырезания селективного гена из генома трансгенных растений – огромный шаг в биотехнологии- была проведена в 1991 году. Ген устойчивости к канамицину, помещеннный межу 2 lox сайтами, вырезался из генома Nicotianum tabacum  в результате экспрессии Cre рекомбиназы (Dale and Ow, 1991). Кроме Cre, для вырезания селективного гена использовались и другие рекомбинационные системы, такие как FLP/ftr 2 µ плазмиды S. cerevisiae (Kilby et al., 1995; Lyznik et al., 1996; Davies et al., 1999; Luo et al., 2000; Gidoni et al., 2001), R-RS система pSR1 плазмиды Zygosaccharomyces rouxii (Onouchi et al., 1995; Sugita et al., 1999, 2000; Ebinuma and Komamine, 2001). В отличие от большинства рекомбиназ, Cre, Flp и R не требуют никаких модификаций и специфических факторов для функционирования в растительном организме. Все эти рекомбиназы относятся к одному семейству интеграз.

Пространственная структура, образуемая комплексом рекомбиназ с их целевыми генами в ДНК консервативна в их каталическом регионе,  а также схожа модель  их работы (van Duyne, 2001). Сайт Днк, расплзнаваемый1 рекомбиназой имеет палиндромную структуру с 6-8 уникальными нуклеотидными парами.