Микрофлора почвы

Результаты обследования почв учитывают при определении  и прогнозе степени их опасности  для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекционной и неинфекционной заболеваемости, схем районной планировки, технических решений по реабилитации и охране водосборных территорий, при решении очередности санационных мероприятий в рамках комплексных природоохранных программ и оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного контроля за объектами, косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Оценка санитарного состояния  почвы проводится по результатам  анализов почв на объектах повышенного  риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т. п.) и  в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям:

1) косвенным, которые характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это -- санитарно-показательные организмы группы кишечной палочки (БРКП, коли-индекс) и фекальные стрептококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика, и как следствие, высоки индексы санитарно-показательных организмов.

2) прямым санитарно-бактериологическим  показателям эпидемической опасности  почвы -- обнаружение возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы);

3) почву оценивают как  чистую без ограничений по  санитарно-бактериологическим показателям  при отсутствии патогенных бактерий  и индексе санитарно-показательных  микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.

О возможности загрязнения  почвы сальмонеллами свидетельствует  индекс санитарно-показательных организмов (БГКП и энтерококков) 10 и более  клеток в 1 г почвы.

Наличие кишечной палочки  в титрах 0,9 и ниже свидетельствует  о несомненном фекальном загрязнении  почвы, притом свежем. Одновременно могут  быть зарегистрированы низкие титры  Cl. perfringens, нитрификаторов. Однако следует иметь в виду, что в первое время после имевшего места органического загрязнения, нитрификаторов может быть мало -- необходимо время, чтобы они успели размножиться.

В процессе самоочищения на разных этапах возникают различные  количественные соотношения этих показателей. Наиболее быстро отмирает кишечная палочка, поэтому при сравнительно высоких  ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения.

Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки при низких титрах остальных 3 показателей характеризует почву  как свободную от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились процессы распада и  минерализации органических веществ.

Высокие титры всех показателей  свидетельствуют о законченных  процессах самоочищения и характеризуют  почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерии и органических загрязнений.

3. Отбор проб и предварительная обработка почвенных образцов для анализа

Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов  санитарного надзора с применением  санитарно-микробиологических методов  исследования, требующими проведения ряда мероприятий по предотвращению загрязнения почвы, являются: детские  и лечебно-профилактические учреждения; сельские и неканализованные районы городских населенных пунктов; территории первого пояса зоны санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения; зоны свалок; отвальные площадки; сельскохозяйственные поля, орошаемые водой из открытых водоемов, стоками животноводческих ферм; земледельческие поля орошения городскими и промышленными сточными водами.

Обязательным предварительным  этапом при санитарно-бактериологическом исследовании является санитарное обследование и составление паспорта обследуемого участка с сопроводительным талоном.

Паспорт обследуемого участка:

1. Номер участка.

2. Адрес участка и его  привязка к источнику загрязнения.

3. Дата обследования.

4. Размер участка.

5. Название почв.

6. Рельеф.

7. Уровень залегания грунтовых  вод.

8. Растительный покров  территории.

9. Характеристика источника  загрязнения (характер производства, используемое сырье, мощность  производства, объем газопылевых  выбросов, жидких и твердых отходов,  удаление от жилых зданий, игровых  площадок, мест водозабора и т.  д.).

10. Характер использования  участка (детская площадка, предприятие  и т. д.).

11. Сведения об использовании  участка в предыдущие годы (мелиорация, применение средств химизации  и др.). Исполнитель, должность.  Личная подпись. Расшифровка подписи.

На основании результатов  санитарного обследования территории и ее описания составляется схематический план земельного участка с нанесением источников загрязнения. Это позволяет правильно обосновать выбор точек отбора проб почвы.

На изучаемой территории при наличии одного источника  загрязнения выделяют два участка 25 м2 каждый: один вблизи источника загрязнения (опытный), другой -- вдали (контрольный). Контрольный выбирают с таким расчетом, чтобы он был заведомо незагрязненным и имел одинаковый почвенный состав с опытным.

3.1 Отбор образцов почвы

Пробы почвы отбираются на каждом из участков в его пяти точках по диагонали или по «конверту» (четыре точки по углам и одна в центре).

Если исследователя интересуют последствия непосредственного  внесения химического вещества в  почву, то пробы отбираются поверхностно (0--1 см) стерильным инструментом (нож, шпатель) в количестве 0,3--0,5 кг в одной точке.

Если изучается воздействие  химического вещества на микрофлору почвенного горизонта, то для отбора проб почвы пользуются следующей  методикой. Каждая точка, в которой  проводится отбор проб почвы, представляет собой центр выбранного для исследования 1 м2 территории. Здесь выкапывается шурф размером 0,3 х 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской. Так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см х 3 см х 3 см; 500 г -- 20 см х 5 см х 30 см.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно  перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают  камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределяют на месте  ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву делят  на 4 треугольника. Почву из двух противоположных  треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями  и так до тех пор, пока не останется  примерно 0,5 кг.

Перед посевом почву диспергируют, т.е. почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просевании сито сверху покрывают стерильной бумагой.

Для учета почвенных микроорганизмов  и энтеровирусов достаточно навески от 1 до 10 г, для санитарно-показательных микроорганизмов от 1 до 30 г, для патогенных энтеро-бактерий (50--50,5 г). Первое разведение навески почвы (1 : 10) делают в стерильной посуде, добавляя стерильную водопроводную воду в соотношении 1 : 10 к весу почвы (например: 1 г воды, 10 г почвы -- в 100 мл воды и т. п.).

Далее проводят предварительную  обработку почвы, целью которой  является извлечение клетки микроорганизмов  из почвенных агрегатов.

Основными приемами предварительной  обработки почвы являются:

1) 10-минутное вертикальное  встряхивание почвенной суспензии  первого разведения в пробирках  с резиновыми пробками -- при навеске почвы 1 г;

2) 3-минутная обработка  почвенной суспензии на механической  мешалке.

Почвенную суспензию, содержащую в 1 мл 0,1 г почвы, через 30 секунд после  предварительной обработки (за это  время оседают грубые минеральные  частицы) используют для приготовления  последовательно убывающих концентраций почвы. Для этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием  почвы 0,1 гмл стерильной пипеткой отбирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 гмл почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001--0,00001 гмл.

Приготовленные разведения используются для посева на различные  питательные среды с целью  определения микробиологических показателей.

К методам определения  микробиологических показателей, характеризующих  фекальное загрязнение почвы, относятся  следующие:

1. Определение количества  бактерий группы кишечных палочек,  энтерококков, энтеровирусов.

2. Определение кишечных  палочек в почве титрационным методом.

3. Определение кишечных  палочек в почве методом мембранных  фильтров.

4. Прямой поверхностный  посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве.

5. Определение в почве  общего количества бактерий,

6. Определение Clostridium perfringens в почве.

7. Определение термофильных  бактерий.

8. Определение в почве  нитрифицирующих бактерий.

4. Определение в почве бактерий

Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида ТТХ). Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 гит. д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред.

Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон-- по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ с трифенилформазаном, выпадающим в виде осадка и придающим среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится.

Посевы на среде Кесслера выращивают 48 часов при 43 °С или 37°С. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился.

При наличии в сосудах  со средой Кесслера газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный  ответ.

При наличии на поверхности  среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2--3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4--5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают коли-титром.

Для характеристики в почве  общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение  численности микроорганизмов, преимущественно  бактерий, присущих на мясопептонном  агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15--20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

После инкубации подсчитывают выросшие колонии.

Определение клостридиум перфрингенс в почве. Из всех приготовленных почвенных разведений (до 1 : 1000 000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С -- 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9--10 мл среды Вильсон--Блер. Инкубация посевов производится при 37° С в течение 24 часов.

Cl. perfringens образуют колонии черного цвета, в мазках -- грамположительные палочки.

Определение в почве нитрифицирующих  бактерий. Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в  почве азотсодержащих соединений, окисляя  аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому  численность этих микроорганизмов  довольно четко указывает на степень  органического загрязнения, скорости и окончания распада органики в почве.

Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего для этих целей применяется среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащей контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14--15 суток.

При развитии нитрифицирующих  бактерий в среде постепенно образуются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять  на 5--7-й день после посева и вторично на 14--15-й день. Титр нитрифицирующих  бактерий чаще всего устанавливают  с помощью качественной пробы  с дифенилаланином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменения окраски.