ДНК-электрофорез — это аналитический метод,
применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам,
заставляют фрагменты ДНК мигрировать
через гель. Сахарофосфатный остов молекул
ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи
ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно,
к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют
медленнее, так как задерживаются в геле,
более короткие молекулы двигаются быстрее.
После разделения (иногда краситель
вносят в расплавленную агарозу) фрагменты
ДНК разной длины визуализируют при помощифлюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих
с ДНК, например, агарозные гели обычно
красят бромистым этидием, который интеркалирует между
азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует
в УФ-лучах.
Определение размеров производят
путем сравнения коммерчески доступных
фрагментов ДНК (DNA ladder, "линейка"),
содержащий линейные фрагменты ДНК известной
длины.
Для ДНК электрофорезов обычно
используют агарозные (для относительно длинных молекул
ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких
молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их
аминокислотной или нуклеотидной последовательности
(от лат. sequentum — последовательность). В результате
секвенирования получают формальное описание
первичной структуры линейной макромолекулы
в виде последовательности мономеров
в текстовом виде. Размеры секвенируемых
участков ДНК обычно не превышают 100 пар
нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов
при секвенировании по Сенгеру. В результате
секвенирования перекрывающихся участков
ДНК, получают последовательности участков
генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов.
Методы секвенирования.
Метод Маскама
и Гилберта (химический).
Один из методов основан
на химической деградации ДНК. Он был предложен
в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван
их именем. Суть метода сводится к следующему:
один из концов фрагмента ДНК метят с помощью
изотопа фосфора 32Р. В последнее время
вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую
метку. Ее можно «цеплять» и к нуклеотидам,
причем для каждого типа нуклеотидов подбирать
различную окраску. Препарат меченой ДНК
делят на четыре порции и каждую из них
обрабатывают реагентом, специфически
разрушающим одно или два из четырех оснований,
причем условия реакции подбирают таким
образом, чтобы на каждую молекулу ДНК
приходилось лишь несколько повреждений. Разрушение идет в 2 этапа. На первом этапе происходит
модификация азотистого основания и последующее
выщепление его. На втором этапе производят
гидролиз ДНК в местах выщепления оснований.
Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом.
Адениновые остатки метилируются по третьему
атому азота, гуаниновые – по положению
N7. Если такую модификацию обработать
0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин.
При последующей инкубации в щелочной
среде (0,1 М NaOH) при температуре +90оС происходит разрушение
сахаро-фосфатной связи в местах выщепления
оснований. Обработка поврежденных молекул
пиперидином приводит к гидролизу ДНК
по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые
основания модифицируются гидразином.
В бессолевой среде модифицируется и цитозин,
и тимин, в присутствии 2 М NaCl модифицируется
только цитозин. При дальнейшей обработке
пиперидином происходит расщепление ДНК
по точкам модификации. Можно использовать
и другие реакции химической модификации
оснований и расщепления по ним молекул
ДНК. В результате получается набор меченых
фрагментов, длины которых определяются
расстоянием от разрушенного основания
до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся
во всех четырех реакциях, подвергают
электрофорезу в четырех соседних дорожках;
затем проводят радиоавтографию, и те
фрагменты, которые содержат радиоактивную
метку, оставляют "отпечатки" на рентгеновской
пленке. По положению отпечатков можно
определить, на каком расстоянии от меченого
конца находилось разрушенное основание,
а зная это основание - его положение. Так
набор полос на рентгеновской пленке определяет
нуклеотидную последовательность ДНК.
Аналогично наблюдают флюоресцентное
окрашивание. Если для каждого из четырех
нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной
метки, то при электрофорезе их наносят
на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов
отмечено штрихами разного цвета, а процедуру
считывания легко автоматизировать.
"Классический"
метод Сэнгера (ферментативный).
Метод секвенирования НК путем
"обрыва цепи" (Ф.Сэнгер) основан на
синтезе новой ДНК-цепи на анализируемой
ДНК-матрице с участием ДНК-полимеразы
в присутствии праймера и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) и на случайном обрыве синтезируемой
цепи при встраивании одного из меченных
разными флуоресцентными красителями
дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP).
Поскольку "обрыв цепи" происходит
статистически, то получается весь набор
ДНК-фрагментов, отличающихся между собой
по длине всего на один нуклеотид. Затем
полученная смесь ДНК-фрагментов обрабатывается
формамидом для расхождения цепей и подвергается капиллярному электрофорезу в полиакриламидном геле, в результате
чего фрагменты распределяются по длине.
Сканирование лазером, возбуждающим флуоресценцию
красителей, которыми были помечены дидезоксинуклеотидфосфаты,
позволяет определить последовательность
нуклеотидов исходной молекулы НК.
Метод пиросеквенирования
Метод секвенирования
НК (П. Ниреном) основан на синтезе новой
ДНК-цепи на иммобилизированной анализируемой
ДНК-матрице с участием ДНК-полимеразы
в присутствии праймера при последовательном
добавлении каждого дезоксинуклеотидтрифосфата
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP). При встраивании нуклеотида
стехиометрически высвобождается пирофосфат
(PPi). Пирофосфат (PPi) ферментом ATP-сульфурилазой
в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата
(dATPαS) превращается в ATP, которая является
"топливом" для фермента люциферазы,
превращающей люциферин в оксилюциферин
с испусканием света. Свет регистрируется
камерой и далее анализируется компьютерной
программой. Невстроенные нуклеотиды
подвергаются деградации ферментом апиразой,
и реакция начинается с новым нуклеотидом.
Бисульфитный
метод.
Метод для определения паттерна
(профиля) метилирования ДНК основан на
бисульфитной обработке ДНК, первращающей
остатки цитозина в остатки урацила, но
не затрагивающей метилированные остатки
5-метилцитозина. Дальнейший анализ сводится
к различению однонуклеотидных полиморфизмов,
и к разделению цитозинов и тиминов в прочитанных
последовательностях.
Жидкостная хроматография (liquid chromatography) [греч. chroma (chromatos) — цвет, окраска
и grapho — пишу, рисую]
— вид хроматографии (см. Хроматография), в которой
подвижной фазой (элюентом) служит жидкость.
Неподвижной фазой при Ж.х. служит твердый
сорбент с нанесенной на его поверхность
жидкостью или гель. Различают колоночную
Ж.х., в которой через колонку, заполненную
неподвижной фазой, пропускают порцию
разделяемой смеси веществ в потоке элюента
(под давлением или под действием силы
тяжести), и тонкослойную Ж.х. (см. Тонкослойная хроматография), в которой элюент
перемещается под действием капиллярных
сил по плоскому слою сорбента, нанесенного
на стеклянную пластинку или металлическую
фольгу, вдоль пористой полимерной пленки,
по поверхности цилиндрической кварцевой
или керамической палочки, по полоске
хроматографической бумаги. Разработан
также метод тонкослойной Ж.х. под давлением
(см. Жидкостная хроматография высокого
давления, ЖХВД). Жидкостная
хроматография высокого давления, ЖХВД
(high pressure liquid chromatography, HPLC) [греч. chroma (chromatos) — цвет, окраска и grapho — пишу, рисую] — вариант
хроматографии (см. Хроматография) с использованием
гранул размером до 3 микрон, при которой
протекание элюента через колонку достигается
за счет давления в 200—300 атмосфер.
Гель-фильтрация (синоним
гель-хроматография) — метод разделения
смеси веществ с различными
молекулярными массами путем фильтрации
через различные так называемые
ячеистые гели. Гель-фильтрация широко
используется для определения
величин молекулярных масс, обессоливания
растворов нативных белков,
концентрирования растворов полимеров.
В
медицине Гель-фильтрация применяют
для диагностического разделения
белков сыворотки крови, например
при макроглобулинемии,
гемоглобинопатиях, при ранней
диагностике беременности, для получения
очищенных препаратов ферментов.
Гель-фильтрация проводят на
хроматографических колонках,
заполненных набухшим гранулированным
гелем, например гелем сефадексов
(коммерческое название полисахаридов
декстранов, прошедших специальную
химическую обработку, в результате
которой между линейными структурами
их молекул образуется множество
поперечных связей, или «сшивок»),
биогелем и т.п., элюируют (вымывают)
разделяемые вещества разбавленными
солевыми или буферными растворами.
Эффективность Гель-фильтрация
определяется размерами пор между
гранулами геля и величиной
ячеек каждой гранулы: мелкие молекулы
вещества (значительно меньше
ячейки геля) диффундируют внутрь гранулы
и задерживаются при фильтрации
через эти своеобразные молекулярные
сита, а более крупные молекулы
не могут попасть в ячейки и проходят в
поры между гранулами. Метод
прост в исполнении и проводится в мягких
условиях, исключающих денатурацию
биологически активных белков, что
важно при работе, например,
с ферментами.
Ионообменная хроматография основанная на разл. способности
разделяемых ионов кионному обмену с фиксированных ионами сорбента,
образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего.
Для разделения катионов используют катиониты,
для разделения анионов - аниониты (см. Иониты). Элюентом в первом случае
служит раствор кислоты, во втором - раствор щелочи. Разделение ионов регулируют подбором
оптим. значений рН элюента. Сильнокислотные
сульфокатиониты и высокоосновные аниониты
могут использоваться при любых значениях
рН, слабокислотные карбоксильные катиониты - только при рН > 6;
слабоосновные аниониты находятся в ионизованном
состоянии при рН < 8. Варьируя рН элюента,
можно резко изменять степень ионизации
компонентов разделяемой смеси (сорбатов)
и, следовательно, время их удерживания,
добиваясь необходимой селективности
разделения.
Белки и нуклеиновые
кислоты разделяют с помощью ионообменной
хроматографии на гидрофильных высокопроницаемых
ионитах на основе целлюлозы, декстранов,
синтетич. полимеров, широкопористых силикагелей;
гидрофильность матрицы ионита уменьшает
неспецифич. взаимод. биополимера с сорбентом.
Бумажная распределительная хроматография была впервые применена
для анализа аминокислотного состава
гидро-лизата шерсти. Сущность бумажной
распределительной хроматографии состоит
в том, что на полоску бумаги наносят микрокаплю
раствора исследуемой смеси веществ, полоску
помещают в герметически закрывающуюся
камеру, насыщенную парами растворителя,
и тот конец бумаги, на который нанесено
вещество, опускают в кювету с подвижным
растворителем ( подвижной фазой), насыщенным
водой. Бумага имеет сильное сродство
с водой, содержащейся в растворителе
и ее можно рассматривать как носитель
неподвижной водной фазы. С помощью бумажной
распределительной хроматографии легко
разделить аминокислоты и определить
их в смеси. Этот метод основан на том,
что органический растворитель, перемещаясь
вдоль полос хроматографической ( фильтровальной)
бумаги, увлекает за собой растворенные
в нем аминокислоты. Каждая аминокислота
в своем движении достигает определенного
уровня. В методе бумажной
распределительной хроматографии в
качестве носителя используется специальная
бумага, приготовленная из высокосортного
хлопка. Она способна удерживать в своих
порах до 22 % воды ( сорбированной из воздуха),
которая играет роль неподвижного растворителя. При
помощи метода бумажной
распределительной хроматографии можно
эффективно производить качественный
и количественный анализ аминокислот,
пептидов, нуклеиновых кислот и продуктов
их распада органических кислот, углеводов,
неорганических веществ.
Цито- и гистохимические
методы исследования направлены на выявление
в клетках и тканях конкретных химических веществ (например, железа,
кальция, белков, липидов, нуклеиновых
кислот, гликогена, ферментов) или химических групп (например, альдегидных,
сульфгидрильных, аминогрупп). Они основаны
на специфическом связывании красителей
с определенными химическими соединениями
или образовании окрашенных продуктов
из неокрашенных в участке расположения
искомого вещества в результате гистохимической
реакции его выявления.
Примером такого рода
цитохимических реакций может быть реакция
на ДНК, реакция Фёльгена.
После специфического
кислотного гидролиза только на ДНК на
дезоксирибозе образуются альдегидные
группы. Эти группы могут взаимодействовать
со специфическим индикатором, реактивом
Шиффа (обесцвеченное основание фуксина),
давая красное окрашивание в местах локализации
ДНК. Связывание красителя в этом случае
строго количественное, что позволяет
не только обнаружить и указать места,
где есть ДНК, но и измерить её количество.
МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)
Метод ПЦР относится к гибридизационным
методам анализа ДНК, основанным на достраивании
комплементарной полинуклеотидной цепи
на одинарной полинуклеотидной цепи -
матрице. Принцип метода ПЦР был разработан
в начале 80-ых годов прошлого столетия
в США. В настоящее время метод широко
используется в научных исследованиях,
в практическом здравоохранении и службе
Госсанэпиднадзора.
В основе метода ПЦР лежит комплементарное
достраивание ДНК матрицы, осуществляемое
in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы
(репликация ДНК). Естественная репликация
ДНК включает в себя несколько стадий;
1) денатурация ДНК (расплетение двойной
спирали, расхождение нитей ДНК);
2) образование коротких двухцепочечных
участков ДНК (затравок, необходимых для
инициации синтеза ДНК);
3) синтез новой цепи ДНК (комплементарное
достраивание обеих нитей).
Ультрацентрифугирование — метод разделения и исследования
высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц
с помощью ультрацентрифуги. Метод
заключается в том, что белки в центрифужной
пробирке помещают в ротор ультрацентрифуги.
При вращении ротора скорость оседания
белков пропорциональна их молекулярной
массе: более тяжелые белки образуют фракции,
расположенные ближе ко дну кюветы, более
легкие — к поверхности.