Лекции по молекулярной биологии

Темы лекционных занятий:

Лекция № 1. Определение  предмета  молекулярной  биотехнологии. Доказательство  способности молекул  ДНК  к  самоудвоению. 

1. Определение  предмета  молекулярной  биотехнологии.

Молекулярная биотехнология (от греч. bios жизнь, techne искусство, мастерство и logos слово, учение) - это получение полезных для человека продуктов, в процессе которого используется биохимическая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов на молекулярном уровне. Сами того не подозревая, люди применяли биотехнологические методы с древнейших времен. 

Занимаясь хлебопечением, виноделием, пивоварением, получением кисло-молочных продуктов, сыров, пищевого уксуса, они использовали деятельность микроорганизмов. Огромную роль в разработке научных основ биотехнологии сыграли работы одного, из величайших естествоиспытателей 19-го века - француза Луи Пастера (1822-1895). Начав свою научную карьеру с чисто химических работ, наиболее известной из которых является исследование винных кислот, послужившее толчком к развитию стереохимии, в 50-х годах 19-го века Пастор занялся изучением брожения. 

В 1857 г. появляется его работа, в которой Пастер доказывает, что спиртовое брожение сахара есть процесс, тесно связанный с жизнедеятельностью дрожжевых грибков, которые питаются и размножаются за счет бродящей жидкости, при этом часть сахара тратится на постройку дрожжевых клеток и образование побочных продуктов - глицерина и янтарной кислоты. Пастер опроверг господствовавшие тогда взгляды Либиха на брожение как на механико-химический акт. 

Периоды развития молекулярной биологии и биотехнологии:

1. Первый романтический период 1935-1944 гг.

Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия занимались изучением репродукции фагов и вирусов, представляющих собой комплексы нуклеиновых кислот с белками.

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдуард Татум сформулировали гипотезу - "Один ген -один фермент". Однако, что такое ген в физико-химическом плане тогда еще не знали.

2. Второй романтический период 1944-1953гг.

Была доказана генетическая роль ДНК. В 1953 г. появилась модель двойной спирали ДНК, за которую ее создатели Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинс были удостоены Нобелевской премии.

3. Догматический период 1953-1962 гг.

Сформулирована центральная догма молекулярной биологии:

Перенос генетической информации идет в направленииДНК → РНК → белок.

В 1962 г. был расшифрован генетический код.

4. Академический период с 1962 г. по настоящее время, в котором с 1974 года выделяют генно-инженерный подпериод.

Ocновныe открытия 

1944 г. Доказательство генетической роли ДНК. Освальд Эйвери, Колин Мак-Леод, Маклин Мак-Карти.

1953 г. Установление структуры ДНК. Джеймс Уотсон, Френсис Крик.

1961 г. Открытие генетической регуляции синтеза ферментов. Андре Львов, Франсуа Жакоб, Жак Моно.

1962 г. Расшифровка генетического кода. Маршалл Нирнберг, Генрих Маттеи, Северо Очоа.

1967 г. Синтез in vitro биологически активной ДНК. Артур Корнберг (неформальный лидер молекулярной биологии).

1970 г. Химический синтез гена. Гобинд Корана.

1970 г. Открытие фермента обратной транскриптазы и явления обратной транскрипции. Говард Темин, ДэвидБалтимор, Ренато Дульбеко.

1974 г. Открытие рестриктаз. Гамильтон Смит, Даниэль Натанс, Вернер Арбер.

1978 г. Открытие сплайсинга. Филипп Шарп.

1982 г. Открытие автосплайсинга. ТомасЧек.

 

2. Доказательство  способности молекул  ДНК  к  самоудвоению. 

1. 1928 г. Опыты Фредерика Гриффита.

Гриффит работал с пневмококками - бактериями, вызывающими пневмонию. Он брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный - патогенный (вирулентный), при инфицировании таким штаммом мыши погибают, бескапсульный - непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших вирулентность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных бактерий, животные погибали в результате размножения капсульных вирулентных форм. Обнаруженное явление Гриффит интерпретировал как трансформацию.

Трансформация - это приобретение одним организмом некоторых признаков другого организма за счет захвата части его генетической информации.

Трансформирующими фактором оказалась ДНК. 

2. 1952 г. Эксперимент Альфреда Херши и Марты Чейз. Фаги (бактериофаги) - это вирусы, размножающиеся в бактериях. Е. coli - кишечная палочка (эубактерия).

Суть опыта: фаги, у которых белковая оболочка была мечена радиоактивной серой (S35), а ДНК - радиоактивным фосфором (Р32), инкубировали с бактериями. Затем бактерии отмывали.

В смывных водах не обнаруживали Р32, а в бактериях - S35. Следовательно, внутрь попала только ДНК. Через несколько минут из бактерии выходили десятки полноценных фагов, содержащих и белковую оболочку, и ДНК.

Отсюда следовал однозначный вывод о том, что именно ДНК выполняет генетическую функцию - несет информацию как о создании новых копий ДНК, тик и о синтезе фаговых белков.

3. 1957 г. Опыты Френкеля - Конрата.

Френкель-Конрат работал с вирусом табачной мозаики (ВТМ). В этом вирусе содержится РНК, а не ДНК. Было известно, что разные штаммы вируса вызывают разную картину поражения листьев табака. После смены белковой оболочки "переодетые" вирусы вызывали картину поражения, характерную для того штамма, чья РНК была покрыта чужим белком.

Следовательно, не только ДНК, но и РНК может служить носителем генетической информации.

На сегодняшний день существуют сотни тысяч доказательств генетической роли нуклеиновых кислот. Приведенные три являются классическиК ферментам матричного синтеза нуклеиновых кислот относятся многочисленные ДНК- и РНК-зависимые ДНК- и РНК-полимеразы, осуществляющие зависимый от матричных ДНК или РНК синтез нуклеиновых кислот. Эти ферменты обычно используются в генной инженерии для получения двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных, а также для обратной транскрипции, т.е. синтеза двухцепочечных ДНК, комплементарных мРНК, которые называют комплементарными ДНК (кДНК).

 

Лекция № 2. Химическая природа  ДНК-полимеразы. Промоторные области. Рекогниция.

1. Химическая природа  ДНК-полимеразы.

Синтез новых полинуклеотидных цепей при репликации катализирует фермент ДНК-полимераза. Реакцию удается осуществить и изучать in vitro, используя ферменты, выделенные из организма. Отметим важнейшие особенности реакции.

1. Субстратами  служат трифосфаты дезоксирибонуклеозидов. В ходе реакции от каждого  из них отщепляется пирофосфатный  остаток; таким образом, включение  каждого мономера в молекулу ДНК требует расхода энергии высокоэнергетических связей.

2. Реакция идет  только в присутствии уже готовой  ДНК, выполняющей роль матрицы. Все  вновь синтезируемые молекулы  ДНК имеют первичную структуру, идентичную первичной структуре  ДНК-матрицы. 
3. Поскольку в молекуле ДНК нуклеотидные остатки образуют пары А—Т и G—С, в реакции расходуются одинаковые количества дАТФ и дТТФ (стехи-ометрический коэффициент т) и одинаковые количества дГТФ и дЦТФ (стехиометрический коэффициент п).

ДНК-полимераза не способна начинать синтез новой цепи с ее первого нукле-отида; она может лишь удлинять уже имеющуюся цепь, присоединяя к ее З'-концу новые нуклеотиды. Поэтому для начала реакции требуется затравка (праймер). Иногда случается ошибка, и фосфодиэфирная связь образуется с нуклеотидом, некомплементарным очередному нуклеотиду матрицы. В этом случае дальнейший рост новой цепи возобновляется лишь после того, как неправильный нуклеотид отщепляется той же ДНК-полимеразой. Таким образом, точность копирования проверяется дважды и поэтому очень высока: на миллиард нуклеотидов только один ошибочный.

ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Кленова), Т4-ДНК-полимераза и в последнее время термостабильные ДНК-полимеразы, особенно ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Все эти ферменты в присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и TTP) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной ДНК, и для функционирования требуют наличия затравки на одноцепочечной матричной ДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3’-ОН-концом, комплементарного матричной ДНК. ДНК-полимераза I E. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5’®3’, 5’®3’-экзонуклеазной и 3’®5’-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК-полимеразы I E. coli (фрагмент Кленова) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5’®3’-экзонуклеазе. Как ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент используются для введения радиоактивно меченных дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник-трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной ДНК, в котором 3’-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5’®3’-экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5’-конца. Кроме того, фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5’-выступающих "липких" концов ДНК с образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3’-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3’®5’-экзонуклеазой этого фермента. Как и ДНК-полимераза I E. coli, Т4-ДНК-полимераза обладает 3’®5’- (но не 5’®3’-) экзонуклеазной активностью, которая у последней, по крайней мере, в 200 раз выше. Это позволяет использовать Т4-ДНК-полимеразу, в частности, для введения радиоактивной метки путем реакции обмена немеченного 3’-концевого нуклеотида на меченный радиоактивным изотопом.

 

2.     Промоторные области. Рекогниция.

Термостабильная Taq-полимераза в настоящее время широко используется для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а ее модифицированный аналог – и для секвенирования ДНК по методу Сенгера. Сущность ПЦР заключается в следующем (рис. II.4). Реакционная смесь обычно содержит исследуемую ДНК, dATP, dCTP, dGTP и TTP, Taq-полимеразу и два синтетических олигодезоксирибонуклеотидных праймера длиной 15–30 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, фланкирующих исследуемый участок ДНК-матрицы. ПЦР начинается с кратковременного (1–2 мин) прогревания реакционной смеси при ~95o, в процессе которого происходит плавление цепей матричной ДНК и инактивация примесных белков, которые могут присутствовать в реакционной смеси, если используется недостаточно очищенная матричная ДНК, например из клинических образцов. Далее реакционную смесь охлаждают до температуры отжига праймеров с матричной ДНК (37–65o). В результате праймеры связываются с комплементарными им местами на матрице и с этого момента начинают служить затравками для синтеза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементарных каждой из цепей денатурированной матричной ДНК. Для проведения синтеза ДНК в оптимальных для Taq-полимеразы условиях температуру реакционной смеси поднимают до 72o и при такой температуре проводят элонгацию цепей вновь синтезирующейся ДНК в течение 0,5–2 мин. По окончании стадии синтеза ДНК заканчивается первый цикл ПЦР, после чего проводятся такие же второй, третий и т.д. в автоматическом режиме. По окончании третьего цикла уже образуется дискретный продукт ПЦР – фрагмент двухцепочечной ДНК, содержащий на своих 5’-концах последовательности нуклеотидов праймеров. Количество продукта ПЦР в реакционной смеси после завершения каждого цикла удваивается и, следовательно, по мере прохождения реакции экспоненциально возрастает, достигая нескольких микрограммов в реакционной смеси объемом 25–50 мкл. По окончании ПЦР содержимое реакционной смеси анализируют электрофорезом в агарозном геле в присутствии бромистого этидия, где продукт реакции выявляется в УФ-свете. Продукт ПЦР можно выделить из агарозного геля в чистом виде и работать с ним, как с обычным фрагментом двухцепочечной ДНК, т.е. гидролизовать рестриктазами, клонировать в плазмидных векторах по "липким" и "тупым" концам, секвенировать или использовать в качестве зондов при гибридизации.

С помощью ПЦР можно амплифицировать in vitro сегменты ДНК длиной от 0,1 до 5–7 т.п.о. и более, а для получения положительного результата достаточно присутствия в реакционной смеси одной–двух копий амплифицируемой последовательности нуклеотидов (например геномной ДНК, содержащейся в одной–двух соматических клетках). При этом не возникает необходимости в тщательной очистке матрицы, так как большинство попадающих в реакционную смесь белков и ферментов инактивируется в первых же циклах ПЦР и не оказывает влияния на протекание реакции при высоких температурах. Благодаря таким особенностям, как простота постановки, высокая чувствительность и воспроизводимость, ПЦР в последнее время получила широкое распространение в фундаментальных и прикладных исследованиях по молекулярной биологии и генетике. Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении тех сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании.

Рекогниция – процесс узнавания тРНК своей аминокислоты, происходящий при помощи фермента аминоацил-тРНК-синтетазы.

Лекция  № 3. Понятие о регуляции активности генов у про- и эукариот.

Гистоны как белки неспецифически регулирующие активность ДНК. Негистоновые белки как белки специфически регулирующие  активность  ДНК.  Возможный  механизм   воздействия негистоновых  белков  на  ДНК  ядра  клетки.   Схема  регуляции   процессов трансляции  и  транскрипции  по  Жакобу, Моно, Львову (1961). 

Взаимодействие белка-репрессора с геном-оператором. Структура lас-оперона E. Coli,  ее  промотора. 

Причины  ошибок  при  синтезе  ДНК,  их  количество in vitro.  Этапы  проверки ДНК при  репарации.  Функция  ферментов  репарации.  Типы  спонтанных  и индуцируемых  повреждений  ДНК   Последствия   нарушений   в системе репарации.  Типы повреждений в ДНК (окисление,  дезаминирование, алкилирование). 

Лекция №4 Способы  выделения ДНК и РНК  из  биологического  материала.

Количество  ДНК  и РНК в клетке. Выделение  геномной  ДНК.  Получение  высокомолекулярного препарата  ДНК.  Выделение  и  очистка  РНК. 

Методы оценки экспрессии генов: иммунодиагностика.

Радиоиммуный анализ. История создания метода. Техника проведения анализа, радиоизотопные метки в  РИА.  Получение  меченых  антител.  Применение  РИА.  Чувствительность, специфичность анализа.