Культуры клеток и тканей

План:

Введение

1.Культуры клеток и тканей

2.Методы культивирования вирусов

3. Вирусологические методы исследования

Заключение

Список использованной литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.

Большая заслуга в деле paзработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

 

 

 

 

 

 

1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма. Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения (виноделие и др.), привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т. е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Были разработаны составы жидких и твёрдых питательных сред, методы, обеспечивающие их стерильность, способы выращивания чистых культур, состоящих из клеток одного вида, и т. д. К сер. 20 в. было освоено культивирование микроорганизмов в промышленных масштабах.

Первые опыты по выращиванию клеток и тканей животных вне организма были сделаны в нач. 20 в. Дальнейшее совершенствование метода шло параллельно успехам цитологии, биохимии, генетики, эмбриологии, молекулярной биологии. Его возможности возросли после того, как научились получать изолированные клетки из различных животных тканей (путём их обработки специальными ферментами, растворяющими межклеточное вещество и разрушающими межклеточные контакты) и выяснили потребности разных клеток в гормонах, факторах роста и др. веществах, вносимых в искусственные питательные среды. Очевидные преимущества работы с генетически однородными клетками и тканями в контролируемых условиях вне организма по сравнению с проведением исследований на целых организмах сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Столь же плодотворным оказалось его применение в медицине и при решении ряда задач сельского хозяйства и биотехнологии.

Клеточные и тканевые культуры использовались для изучения закономерностей митоза и числа клеточных циклов (делений) у клеток разных типов и выяснения в связи с этим «запрограммированности» процесса старения, для изучения механизмов клеточной дифференцировки, формирования специализированных тканей и органов, а также (при совместном культивировании) влияния друг на друга клеток разных типов. Культура клеток и тканей растений появилась позднее – в 1958 г., но уже всего через 6 лет из единственной клетки, извлечённой из корня моркови, удалось в условиях культуры вырастить целое растение с дифференцированными тканями и органами. Это направление широко применяется в селекции и биотехнологии.

Совместное культивирование клеток разных линий (клонов) привело к рождению нового важного раздела в экспериментальной биологии – генетики соматических клеток и прежде всего метода гибридизации соматических клеток.

Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т. ч. к лекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенности этих факторов, т. е. их способность вызывать мутации и опухоли. Разработка методов длительного культивирования позволяет формировать банки клеточных линий, обладающих определёнными генетическими и биохимическими свойствами. На этой основе создаются методы криоконсервации (от греч. «криос» – холод) – сохранение в условиях глубокого охлаждения клеток, тканей и органов для трансплантации (пересадки), в качестве резервного генофонда редких и исчезающих биологических видов, а также для других целей. С кон. 20 в. стали возникать банки, в которых хранятся замороженные стволовые клетки, используемые для лечения самых различных болезней и травм.

Клеточные культуры служат также удобными объектами для изучения тканевой несовместимости и других иммунных реакций. Они используются в диагностике вирусов и для получения вакцин. Таким образом, культура клеток и тканей применяется для решения как фундаментальных теоретических проблем (таких, напр., как клеточная дифференцировка), так и различных практических задач, особенно в области медицины. Этот метод – неотъемлемая составная часть генной инженерии, клеточной инженерии, клонирования и других направлений экспериментальной биологии.

2.Методы  культивирования вирусов.

- метод вирусологической работы, при котором для накопления  и изучения вируса используются  культуры тканей; данный метод  нашел широкое применение в  научных исследованиях, в диагностической  практике, а также при производстве  вирусных профилактических и диагностических препаратов. Существует несколько видов клеточных культур, в разной степени пригодных для вирусологических целей:                                                                                             

-первичные культуры, получаемые путем выращивания клеток, диспергированных непосредственно из фрагментов ткани;

-вторичные культуры, получаемые из первичных путем пересева, иначе субкультивирования;

-непрерывные “бессмертные” клеточные линии, способные поддерживаться в серийных пассажах неопределенно долгое время;

-штаммы диплоидных клеток, по существу такие же непрерывные линии, но сохраняющие характерную диплоидную конфигурацию хромосом на определенном числе пассажей;

-переживающие культуры, т. е. небольшие участки ткани, извлеченные из организма и остающиеся жизнеспособными IN VITRO без размножения, и, наконец

-органные культуры, представляющие фрагмент органа и состоящие из нескольких различных тканей. Кроме того, культуры тканей могут подразделяться по виду животного, от которого они происходят; по типу ткани; по состоянию ткани на момент извлечения (нормальные, опухолевые), по способу выращивания (многослойные, суспензионные, на микроносителях, капиллярах и т.п. ).

Условия заражения культур, сроки размножения вируса, методы наблюдения за зараженными культурами и способы сбора вирусного “урожая” зависят от конкретной системы вирус-клетка и определяются экспериментально (см. размножение вирусов. В понятие культивирование входит также выращивание вируса в тканях полостей развивающегося эмбриона птиц.

Из вирусов гепатитов человека только вирус гепатита А способен надежно культивироваться в клеточных системах;

известно несколько типов первичных, перевиваемых и диплоидных клеточных культур, к которым этот вирус может быть серийно адаптирован. Описаны также первые успешные попытки культивирования вируса гепатита С и вируса гепатита Е.

3. Вирусологические методы  исследования

Методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

 Вирусологические методы исследования  основаны также на иммунологических  процессах (взаимодействие антигена  с антителами), биологических свойствах  вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

 В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении  и идентификации вирусов, а также  при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

 Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

 В искусственных питательных  средах можно культивировать  кусочки отдельных органов и  тканей (органные культуры). Эти типы  культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

 В зараженных клеточных культурах  вирусы можно обнаружить по  изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

 Выделение вирусов является  трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

 Для выделения вирусов применяют  заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

 Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.