Контрольная работа по «Биотехнологии»

Рис. 1. S – образная кривая роста микроорганизмов

1 и 2 (лаг-фаза  и фаза ускорения роста) – побор  условий культивирования и состава  питательной среды; 3 (лог-фаза) –  синтез первичных метаболитов, образование  биомассы; 4 и 5 (фаза торможения и  стационарная) – синтез вторичных метаболитов, «урожай биомассы»; 6 (фаза отмирания) – процессы стерилизации внутриклеточные метаболиты.

 На  рис.1 видно, что синтез первичных метаболитов происходит на всех стадиях, а уровень их синтеза определяется, в основном, количеством клеток и наличием питательных веществ.

Более сложный характер имеет синтез так называемых вторичных метаболитов.

 Синтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит не всегда, а лишь в определенных условиях, обычно неблагоприятных для клеток. Если взглянуть приведенную выше кривую роста, то можно предположить, что синтез таких соединений возможен начиная с конца Log-фазы  и до конца фазы отмирания. Именно в это время происходит исчерпание основных компонентов питательной среды и одновременно происходит накопление в среде избыточных количеств продуктов первичного метаболизма, обычно весьма токсичных в больших концентрациях для клеток. Данную ситуацию для клеток можно охарактеризовать как стрессовую. Это приводит к дезорганизации нормального метаболизма и как следствие к прекращению размножения клеток. Предполагается, что в этих условиях некоторые продукты первичного метаболизма могут выступать в качестве индукторов или дерепрессоров генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма. Согласно другому предположению гены вторичного метаболизма подвержены катаболитической репрессии продуктами разложения глюкозы, исчерпание которой снимает репрессию. Такой этап несбалансированного роста, сопровождающийся синтезом вторичных метаболитов  называется идиофазой, а продукты – идиолитами. Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики, стероиды и алкалоиды. Такие соединения как аминокислоты, кислоты цикла Кребса, глицерин, формально являются первичными метаболитами, однако их избыточное образование и накопление возможно, только в условиях нарушения нормального метаболизма клеток. Поэтому фактически, в этом случае, они тоже являются идиолитами.

 Процесс  промышленного биосинтеза идиолитов проходит две фазы или стадии (двустепенчатое культивирование), резко различающиеся по условиям проведения. Во время первой фазы (трофофазы) основной задачей является накопление максимально возможного количества биомассы, которая выращивается на среде оптимальной для роста данного микроорганизма (ростовая среда). Из экономических и технологических соображений эта фаза должна быть максимально быстрой, а питательная среда дешевой и содержать легко усваиваемые субстраты (глюкоза, фруктоза). На второй фазе создаются условия обеспечивающие  запуск и активный синтез вторичного метаболита. На этой фазе ферментацию обычно ведут на так называемой продуктивной среде, которая по своему составу значительно отличается от  ростовой, т.к. содержит, в основном, трудноусваиваемые углеводы. Переключение клеток с легко усваиваемых  субстратов (глюкоза) на более сложные (лактоза, сахароза) требует синтеза большого количества новых индуцибельных ферментов, что является для клеток “встряской”, аналогичной той, которую может испытать человек при резком торможении или маневре на автомобиле, который двигался с большой скоростью. Наработанная на первом этапе (в трофофазе) клеточная культура может быть перенесена (пересеяна) на продуктивную среду в другом аппарате или культивирование может осуществляться на сложных питательных средах, содержащих как легкоусваиваемые, так и трудноусваиваемые компоненты. Поскольку в структуру молекул многих вторичных метаболитов кроме углерода, водорода и кислорода входит значительное количество азота, серы, фосфора, то в состав продуктивных сред обязательно нужно добавлять в необходимых количествах нитраты, соли аммония и фосфорной кислоты и другие микроэлементы. Существует целый ряд физических (температура, рН, освещение светом определенной длины волны и интенсивности) и химических (добавление веществ-предшественников, поддержание определенной, обычно высокой концентрации кислорода)  факторов благоприятствующих синтезу вторичных метаболитов. 
Задача 4.

В поиске и создании наиболее безопасных и эффективных лекарственных средств большая роль отводится таргетному скринингу.

Объясните, что такое таргетный скрининг и как он работает?

После завершения предклинических испытаний, при благоприятных результатах, когда ставится вопрос о передаче препарата в клинику, обычно начинается углубленное изучение механизма его действия на субклеточном и молекулярном уровне, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени или, по недавно укоренившейся терминологии "таргета" (target-мишень), - макромолекулы или макромолекулярного комплекса. Затем выявляется ген, кодирующий образование этой макромолекулы или гены, которые кодируют образование макромолекул, входящих в макромолекулярный комплекс.

Новая технология скрининга, создается на основе знания полностью секвенированного (генома, в котором определена последовательность  миллионов пар (А-Т, Г-Ц) нуклеотидов ) генома патогенна и «существенных» генов в геноме. В лабораториях, работающих в области создания новых антимикробных лекарств, предварительно выбирается ген, который будет использован для их испытания как таргет (точнее как таргет, будет использован продукт этого гена). Международные базы данных позволяют получить сведения о гене и его распространенности среди патогенов; о продукте, кодируемом этим геном; и об участии этого продукта (как правило, фермента) в том или ином метаболическом цикле; о катализировании им конкретной реакции в цикле. Иными словами, исходным тест-объектом для отбора антимикробных веществ, избирательных ингибиторов метаболизма, является не микробная культура, а ген, или точнее, кодируемый им продукт.

Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена вести отбор биологически активных веществ, в частности, антимикробных препаратов с запланированным иным механизмом действия в отличие от традиционного метода (поиск, ведущийся методом от клетки к гену). Первый этап таргетного скрининга начинается с выделения этого гена (соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Далее, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР), фрагмент ДНК амплифицируется. Количество копий гена умножается. Конструируются:

1) бесклеточная система, где наработанная  матрица служит для получения  информационной РНК, специфичной  для гена;

2) бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукт, кодируемого данным геном.

Следует отметить, что методика ПЦР, а также методы получения бесклеточных систем транскрипции и трансляции в настоящее время достаточно хорошо отработаны и в значительной мере автоматизированы. Бесклеточная система, непосредственно используемая для испытания, первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ - ингибиторов фермента, (продукта изучаемого гена), содержит этот продукт и его субстрат (субстраты).

 После того, когда наработан белок, устанавливается функцию этого белка, например, какую реакцию он катализирует как фермент, для того, чтобы по подавлению этой реакции отбирать ингибиторы. Если имеется близкое сходство белка с белком из "модельного" организма, подобрать бесклеточную систему - субстрат для нового белка, не является трудной задачей. Если сходство есть, но не очень близкое, прибегают к анализу "мотивов" - коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине белковой цепи при выравнивании и могут оказаться сходными у двух белков. Когда такого сходства нет, или сходство обнаружено, но нет ясности в функции самого гомолога, то есть белка, взятого для сравнения, то прибегают еще к одному пути установления функций изучаемого белка. Устанавливают, с какими белками он контранскрибируется. Если транскрипт - часть полицистронной информационной РНК, необходимой для протекания в последующем определенного метаболического процесса с участием нескольких ферментов, тогда поиск функции изучаемого белка, включенного в группу этих ферментов, сужается.

В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых генов многочисленны и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, в конечном счете, проводить серийные испытания потенциальных ингибиторов функций почти любого из тысяч генов, составляющих геном патогена и обнаруживать все возможные "уязвимые точки" микробной клетки. Подобный путь достижения цели породил в литературе термин "обратная генетика" - исследование ведется не от клетки и ее фенотипа к гену и геному, а, наоборот, от гена к клетке, и к ее фенотипу. Что касается скрининга лекарственных веществ, осуществляемого таким путем, то он получил название "таргетного скрининга" или «скрининга по мишени». Таргетный скрининг и его технология имеют неоспоримое достоинство в том, что любой ген становится доступен для ингибиторов его функций. Однако, в отношении таргетного скрининга высказываются и критические замечания, которые не носят принципиального характера. В них отмечается, что обнаружение ингибитора таргета – это только начало пути создания антимикробного агента, пригодного для клиники. Требуется, например, чтобы это вещество проникало через оболочку микробной клетки, не подвергалось ферментативной инактивации и т.п. Тем не менее, таргетный скрининг с некоторыми его модификациями и дополнительными тестами, начинает занимать важное место в создании антимикробных лекарств.

Задача 5.

Каким образом в подготовительной стадии ферментационного процесса обеспечивается асептика производства?

Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии. На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы:

1)Приготовление среды, обычно жидкой, включающей необходимые компоненты питания для биотехнологической стадии. Стерилизация среды — для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры. Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление из них микробов - контаминантов или разрушение (гибель) последних. Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. При периодическом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды  протекают последовательно во времени в одном аппарате. Это может быть ферментер, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагревают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Сам процесс нагрева осуществляют либо путем прямого введения (инжекции) струи перегретого пара с температурой до 1300С в питательную среду, либо подачей пара в тепловую рубашку аппарата. Непрерывное нагревание среды может быть осуществлено без прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике, который встроен в стерилизатор или стоит перед ним. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым  введением (инжектированием) перегретого пара (100-1400С), полученного в паровых контактных нагревателях. Твердые сыпучие среды, используемые для поверхностного способа культивирования, стерилизуют паром, иногда инфракрасными и γ-лучами. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до t 40 ◦С.

2)Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха, является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах и технологических помещениях . Технически и экономически оправданным в промышленности  является способ очистки больших количеств воздуха  на фильтрах с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степе чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузионному механизмам осаждения. Если очищенный воздух используют в процессе поверхностного культивирования то он должен быть дополнительно кондиционирован до необходимой температуры и влажности.

3)Подготовка посевного материала. Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым  к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды  с  последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду  возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты). Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых  наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате.

4)Подготовка биокатализатора. Стадия ферментации осуществляется в биотехнологическом реакторе (ферментере) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта. Ферментер – это реакционная емкость, в которой обеспечивается питательное и физиологическое окружение культуры, необходимое для ее роста или получения нужных продуктов метаболизма.

Принципы оснащения биопроизводств:

1. Конструкционное совершенство и относительная универсальность биоректоров.

2. Инертность и коррозионная стойкость материалов биореакторов, другого технологического оборудования, влияющих на биообъект или контактирующих с ним или продуктами его метаболизма.

3. Эксплуатационная надежность технологического оборудования.

4. Доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены, очистки, обработки антисептиками и дезинфектантами узлов и соответствующих частей оборудования.

Согласно первому принципу, желательно конструировать биореакторы, которые можно использовать для реализации биотехнологических процессов, основанных на использовании разных биообъектов (бактерий, грибов, клеток растений и животных).

Учитывая инертность материалов биореакторов, при выборе конструкционных материалов биореакторов используют нержавеющую сталь, стекло, керамику, титан, чугун и т.п. Хром, никель, молибден как лигирующие элементы повышают жаростойкость и химическую стойкость чугуна. Полиэтилен и другие полимерные материалы также широко используют в биотехнологическом процессе.