Конструирование химерных белков

 Используя Taq-полимеразу, удалось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости после каждого цикла реакции добавлять новую порцию фермента. Такое упрощение процедуры позволило автоматизировать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенесение образца с определенным интервалом времени в разные температурные условия: 90—95 °С (температура денатурации) и 60—70 °С (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, высокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жесткие температурные условия отжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в заданном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода.

 Используя метод ПЦР, можно  in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин (см. главу 3). Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала.

 Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного

5.Контроль над исследованиями  рекомбинантных ДНК

 Споры о роли генетики  начались задолго до современного  расцвета генной инженерии. Еще  в 1970-х годах не только ученое  сообщество, но и широкая публика  принялись обсуждать вопросы,  связанные с противоречивыми  перспективами новых биологических  технологий. В чем же заключался  основной вопрос? Основной темой  споров была рекомбинантная ДНК,  которую называли также химерной  ДНК. В лабораторных условиях  стало возможным создавать искусственные  ДНК, комбинируя между собой  гены разных видов и получая  такие сочетания, которые бы  никогда не встретились в природе.  Большинство искусственных ДНК  синтезируются в научных целях.  Это контролируемые эксперименты, на основе которых ученые стремятся  получить новые сведения об  изучаемых ими биологических  системах. Однако в некоторых  случаях исследователям просто  любопытно «посмотреть, что получится». Часто получаются ожидаемые результаты, но порой происходит нечто  неожиданное. И это вполне объяснимо  с научной точки зрения: ведь  мы никогда не можем заранее  все знать и все предсказать.  Поэтому ученые никогда не  могут обещать, что полученные  ими клетки с рекомбинантными  ДНК будут абсолютно безопасными.  Именно такая неуверенность и  послужила отправной точкой для  дискуссий по поводу опасностей  современной генетики.

С такой проблемой столкнулись  молекулярные биологи, изучавшие в 1970-х годах гены вирусов, вызывающих возникновение рака, и внедрявшие их в бактерии Е. coli. При этом они руководствовались благими намерениями: изучить функции раковых генов на примере простых биологических систем. Но с помощью данной технологии можно было бы создать и вредные канцерогенные бактерии, заражающие людей. По мере развития технологии ученые все более приходили к мысли об опасном направлении своей работы и задумывались о ее глобальных последствиях. В конце концов, 11 известных молекулярных биологов опубликовали открытое письмо в престижных журналах «Nature» и «Science», призвав своих коллег наложить мораторий на определенные виды экспериментов и с большей осторожностью относиться к остальным опытам. В частности, они предлагали ввести запрет на эксперименты с генами устойчивости к антибиотикам, генами токсинов и генами канцерогенных вирусов; призывали организовать дискуссию на эту тему; просили Национальный институт здоровья США (NIH) разработать правила и принципы проведения подобных экспериментов.

 Для ученого сообщества это  был шаг огромной важности: перед  лицом неизвестной и в общем-то не вполне определенной опасности ученые осознанно воздерживались от проведения экспериментов. Подписавшиеся под этим письмом, по всей видимости, не ожидали, какой резонанс вызовет их заявление во всем мире.

Как только о письме стало известно средствам массовой информации, широкая  публика восприняла потенциальную  опасность, как вполне реальную. «Если  бы эти эксперименты не были так  опасны, — часто рассуждали люди со стороны, — то разве ученые стали  бы их запрещать?» Однако технология получения рекомбинантных ДНК открыла  совершенно новые направления исследований. Перспективы получения Нобелевской  премии и огромных экономических  выгод также смущали ученых. Ко времени проведения дискуссий многие из них уже стремились не столько  обсудить возможные этические проблемы, сколько убедить публику в  безопасности своих работ. То, что  начиналось как ответственный поступок, превратилось в нежелание допускать  в свои планы непосвященных. И  хотя многие противоречия к нашему времени уже удалось более  или менее разрешить, да и накал  страстей снизился, было бы полезно  кратко напомнить о сути этих споров.

 С 24 по 27 февраля 1975 года ряд  известных во всем мире молекулярных  биологов собрался в Аси-ломаре, близ города Монтерей в штате Калифорния. Некоторые из собравшихся заявили, что этические опасения преувеличены и потребовали продолжения важных исследований. Другие были обеспокоены возможными законодательными постановлениями или судебными преследованиями, если будет доказано, что исследования представляют опасность для здоровья. Многие же просто считали, что они попусту тратят время. На конференции было принято постановление продолжать исследования и заменить мораторий на ряд принципов, которых следует придерживаться при проведении экспериментов с различной степенью риска. Были высказаны следующие предложения:

 увеличить число уровней  безопасности для экспериментов,  представляющих высокую степень потенциального риска;

использовать ослабленные разновидности  генетически измененных микроорганизмов  в специальных лабораторных условиях.

 Главная трудность тогда  (впрочем, как и сейчас) заключалась  в том, чтобы оценить степень  риска таких обстоятельств, о  которых еще мало что известно. Национальный институт здоровья, финансирующий большую долю биологических  проектов, взял инициативу в свои  руки и разработал ряд положений,  предложив их для открытого  обсуждения. Для определения правил  проведения исследований был  образован Комитет по рекомбинантной  ДНК, состоявший из экспертов  разных областей биологии, а также  из представителей частных компаний, использующих новые технологии. Последующие дискуссии также  развертывались в основном вокруг  возможных опасностей. И хотя  от представителей промышленных  компаний стоило ожидать того, что они будут ратовать за  практически свободное экспериментирование,  многие из них проявили ответственность  и высказались за регулирование  исследований. Они тоже опасались  возможных негативных последствий  и судебных исков в случае  нанесения ущерба с их стороны,  а потому также предложили  разработать основные принципы. Другие же ученые утверждали, что им не дают работать, хотя  исследования в области рекомбинантной  ДНК помогли бы решить такие  глобальные проблемы, как голод  и инфекционные болезни.

23 июня 1976 года Дональд Фредериксон, директор Национального института здоровья, утвердил ряд формальных правил исследований в области рекомбинантной ДНК, придерживаться которых должны были все, кто получает гранты от этого института. В них были определены четыре уровня физической безопасности исследований согласно оцененной степени их риска. Первый уровень — безвредные эксперименты с использованием стандартных биологических технологий. С каждым последующим уровнем количество ограничений и предостережений возрастало настолько, что для экспериментов четвертого уровня — вроде тех, что показаны в фильме «Штамм Андромеды», — подходящих лабораторий не существовало вплоть до 1978 года. Кроме того, три штамма Е. coli были распределены по трем уровням биологической безопасности. Стандартные лабораторные штаммы обозначили как ЕК1. Штаммы ЕК2 были определены как характеризующиеся преднамеренно вызванной мутацией, способные выжить вне лаборатории с вероятностью 1 х 10-8. ЕКЗ — те же штаммы, только совершенно не способные выжить в организмах животных и растений или вне лаборатории. Для того чтобы вырастить ослабленный штамм Е. coli, в который можно было бы внедрить рекомбинантную ДНК, Рой Кер-тисс, член комитета при Национальном институте здоровья, разработал штамм хи-1776 (в честь 200-летия провозглашения независимости США), содержащий 15 отдельных блоков для нормального размножения. Роль, которую образованная публика может сыграть при решении вопросов, связанных с регулированием потенциально опасных научных исследований, прояснилась в ходе одного из обсуждений в Кембридже (штат Массачусетс). В тот день, когда были опубликованы правила проведения генетических экспериментов, мэр Кембриджа Альфред Ве-луччи открыл публичные слушания по поводу предложения построить специальную лабораторию по переносу генов животного вируса SV40 в Е. coli. Это предложение выдвинул Марк Пташне, ученый Гарвардского университета. На этом слушании присутствовал один из авторов этой книги. В Кембридже, где располагаются Гарвардский университет и Мас-сачусетский технологический институт, конечно же уже имелись многочисленные лаборатории, где проводились генетические эксперименты, но строительство нового здания требовало разрешения городского совета, и предложение Пташне, получившее широкую огласку, решили обсуждать на открытом заседании.

В течение двух с половиной часов  перед представителями телевидения, радио и прессы, а также перед  сотнями собравшихся выступали  сторонники и противники строительства. Одни ученые приводили аргументы  о необходимости строительства, утверждая, что такая лаборатория  необычайно полезна для изучения рака, тогда как риск выведения  опасных бактерий «крайне невелик». Другие ученые и представители общественности утверждали, что непредвиденные инциденты  уже неоднократно происходили в  самых надежно защищенных лабораториях и что, если будут выведены опасные  микроорганизмы, их уже нельзя будет  остановить. Вопросы мэра и его  советников показывали, что они хорошо подготовились к слушаниям и  ознакомились с материалом. В заключение мэр потребовал наложить двухлетний мораторий на все исследования рекомбинантной ДНК, проводимые в Кембридже, но городской  совет предложил создать Экспериментальный  гражданский совет по пересмотру (CERB) в составе восьми членов, не принадлежащих  к кругу ученых. В него вошли  четыре мужчины и четыре женщины: врач, философ, агент по продаже горючего, инженер-проектировщик, клерк, медсестра, социальный работник и домохозяйка. Члены совета ознакомились с необходимыми специальными сведениями из молекулярной биологии и в январе 1977 года вынесли  единогласное решение — одобрить строительство лаборатории. Этот комитет  создал прецедент для последующих  слушаний подобного рода по поводу исследований в области рекомбинантной ДНК. Данный случай показал, что обычные  граждане вполне способны понять научные  проблемы и вынести здравое решение, не препятствующее развитию науки и  не представляющее опасности для  общества.

В Великобритании вопрос о рекомбинантной ДНК был решен иным образом. Правительство  учредило Консультативную группу по генетическим манипуляциям (Genetic Manipulation Advisory Group, GMAG), в состав которой вошли политики, ученые и представители профсоюзов. Все предлагаемые эксперименты в области рекомбинантной ДНК должны получить одобрение GMAG, принятое на основе современных данных. Основное отличие от американской практики состоит в отсутствии общественного обсуждения, в объединении в одном органе представителей правительства, частного сектора и ученых и в том, что решение может быть изменено в свете последующих научных открытий. В настоящее время как минимум семь стран Европы учредили комитеты по генной инженерии. Канадский Медицинский исследовательский совет придерживается постановлений Национального института здоровья, но уделяет особое внимание вирусам и клеточным культурам млекопитающих.

 Генетически модифицированные  организмы

 Вопросы общественного влияния  на генетику и регулирования  научных исследований в этой  области, во многом не решены  до сих пор. По мере совершенствования  микробиологических технологий  и методов появляются все новые  и новые поводы для беспокойства. В настоящее время речь уже  идет не о том, чтобы добавить  несколько новых генов лабораторным  бактериям. В наше время вполне  доступной стала технология создания  в коммерческих целях генетически  модифицированных организмов, то  есть трансгенных растений и животных с заданными признаками. Многие трансгенные организмы до сих пор содержатся в лабораториях для тестирования, но некоторые уже выпущены на рынок. Трансгенные технологии стали очередным поводом для жарких споров, так как здесь сошлись интересы получения выгоды и сохранения окружающей среды и здоровья людей. Вопрос сводится к тому, насколько безопасно внедрять в организм чужую ДНК и насколько далеко можно предвидеть результаты такого внедрения. Последние десять с лишним лет, в течение которых генетически модифицированные продукты использовались достаточно широко, доказали, что эти технологии не такие уж безвредные. Например, в некоторых случаях инсулин, полученный от трансгенных бактерий, приводил к неблагоприятным последствиям. Однако и особо опасных ситуаций еще не возникало. Национальный институт здоровья пересмотрел некоторые свои рекомендации, и теперь генетики могут пользоваться значительной свободой в своих экспериментах, хотя наиболее опасные из них по-прежнему находятся под контролем. Вопросы по поводу модифицированных организмов остаются, и стоит упомянуть хотя бы некоторые из них.

Первыми генетически модифицированными  организмами были бактерии центров  кристаллизации льда и помидоры сорта  Flavrsaver, выведенные еще в 1970-х годах. Бактерии предназначались для того, чтобы после распыления на растениях они образовывали центры кристаллизации льда; таким образом можно было бы немного повысить устойчивость сельскохозяйственных культур к холоду и увеличить период роста. Помидоры должны были созревать позднее обычного, чтобы дольше сохраняться на складе. Планировалось также уменьшение отходов из-за помятых и слишком мягких экземпляров. После шумных протестов общественности разведение этих организмов запретили.

Многие генетики восприняли шум  вокруг модифицированных продуктов  как своего рода бурю в стакане  воды, и, действительно, за первыми протестами последовало несколько относительно спокойных лет. Но два события  показали, что некоторые представители  общественности настроены резко  против внедрения достижений современной  генетики в повседневную жизнь. Сначала  в 1993 году некто по прозвищу Унабомбер (позже выяснилось, что его настоящее имя Теодор Качински) послал почтой бомбу ведущему американскому генетику Чарльзу Эпштейну в знак протеста против «новой генетики». Этот инцидент получил широкое освещение в прессе. Позже, в 1996 году, многие газеты и журналы обошли фотографии, на которых члены организации «Гринпис» протестуют против генетически модифицированных продуктов. Это было довольно серьезное, хорошо организованное мероприятие с сотнями участников на надувных лодках «Зодиак» и большими плакатами с надписью «Остановим генетическое загрязнение». Своей мишенью «гринписовцы» выбрали грузовые суда, доставлявшие трансгенную сою из Северной Америки в Европу. Для ванкуверских генетиков (таких, как А. Гриффите и Д. Сузуки, авторов этой книги) это событие стало поистине двойным потрясением, поскольку организация «Гринпис», поначалу боровшаяся с китобойным промыслом и испытаниями ядерного оружия, зародилась именно в Ванкувере. Каким же ударом было узнать, что в разряд своих врагов она включила и «злых генетиков»! За последние несколько лет лихорадка протеста распространилась быстрыми темпами и охватила весь цивилизованный мир. Многочисленные демонстрации против генетически модифицированных продуктов стали обычным явлением; решительно настроенные члены радикальных группировок выражают свое гражданское неповиновение тем, что уничтожают трансгенные растения и даже пытаются разрушить фабрики по их производству и научные центры. Недавно вышел номер журнала «Экономист», на обложке которого была изображена чудовищная картофелина «Франкенфуд», восклицающая: «Кто боится ГМ-пищи?» (ГМ — генетически модифицированный продукт). В то же время и надежды ученых на то, что с помощью генетически модифицированных продуктов удастся накормить бедные страны и решить проблему голода, также не сбылись. Об этом мы поговорим далее.