Автор работы: Пользователь скрыл имя, 23 Декабря 2014 в 20:15, реферат
1. Виды ДНК проб. Применение в цитогенетической практике.
2. Патогенез и классификация наследственных болезней.
Вопросы:
ДНК - проба(зонд)— фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности. Для мечения зонда могут быть использованы хромофоры (флуоресцентное мечение), радиоактивные изотопы или группы, делающие возможным детектирование в ходе последующей ферментативной реакции (например, биотиновое мечение).
ДНК-зонды могут быть использованы для гетерогенного детектирования целевых нуклеиновых кислот, при которой мишень или зонд прикрепляют к твёрдой фазе или гелевой подложке. После осуществления гибридизации несвязанные избыточные молекулы зонда отмывают. Введённая в ДНК-зонд метка позволяет определить области, в которых произошло связывание ДНК-зонда и мишени.
К такому типу детектирования относятся саузерн-блот, нозерн-блот, дот-блот, ДНК-микрочип и флуоресцентная гибридизация in situ(FISH).
ДНК-зонды также используют для гомогенного детектирования целевых нуклеиновых кислот без удаления избыточных количеств зонда. При этом успешная гибридизация должна сопровождаться детектируемым изменением определённых свойств зонда. Одно из преимуществ детектирования в гомогенной системе заключается в том, что можно проследить гибридизацию нуклеиновых кислот в реальном времени, при необходимости даже в живой клетке. ДНК-зонды в гомогенной фазе используются в полимеразной цепной реакции в реальном времени(ПЦР).
В общих чертах гибридизация нуклеиновых кислот состоит в следующем:
В современной диагностике хромосомных патологий используются несколько основных методов цитогенетического анализа: классический цитогенетический анализ (кариотипирование), ПЦР-диагностика (метод полимеразной цепной реакции), цитогенетический анализ с использованием флуоресцентных красителей (FISH), микрочипирование.
Классический цитогенетический метод применяется для анализа кариотипа и его аномалий у отдельных индивидуумов. Кариотипирование позволяет успешно проводить анализ анеуплоидии и трисомии, крупных транслокаций, инверсий и делеций хромосом.
Для проведения исследования достаточно получить образец периферической крови пациента объемом 1-2 мл. Анализ кариотипа проводят в три этапа: культивирование лимфоцитов крови, окраска препарата и его микроскопический анализ.
Культивирование проводят для того, чтобы стимулировать деление лимфоцитов, так как успех цитогенетического исследования зависит от количества клеток, находящихся на стадии метафазы, когда хромосомы находятся в наиболее компактной форме. Для увеличения количества метафазных клеток в конце культивирования в среду вводят колхицин, который приостанавливает деление на стадии метафазы, разрушает веретено деления и увеличивает конденсацию хромосом. Далее клетки помещают в гипотонический раствор, который приводит к разрыву ядерной оболочки и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. На следующем этапе клетки фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, их суспензию раскапывают на предметные стекла и высушивают.
В зависимости от целей кариотипирования используют различные методы дифференциального окрашивания хромосом (G-, R-, C-, Q-методы). Процедура окрашивания занимает несколько минут и приводит к появлению рисунка поперечной исчерченности, специфичного для каждой хромосомы.
Световое микроскопирование окрашенных препаратов является самым трудоемким этапом всего исследования, требующим высокой квалификации. Для выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. Большой эффективностью обладают методы компьютерного анализа хромосом.
Метод ПЦР более востребован при анализе моногенных наследственных заболеваний, обусловленных точечными мутациями и делециями. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний, которые можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.
Нужный ген амплифицируют (процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК, как правило, содержащих определённые гены либо сегменты структурного гетерохроматина) с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций.
В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки.
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий:
Для количественного определения амплифицированной ДНК используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.
Виды зондов:
Мечение двуцепочечной ДНК. В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый syberGreen.
Метка, работающая в фазу элонгации. Существует другой способ использования зондов, к которым с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии два химических реагента будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится.
Флуорогенная шпилька (Метка, работающая в фазу отжига) — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать [пространственную структуру| вторичная структура ДНК] — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации.
Метка, основанная на методе FRET. Другой вариант мечения вновь-образующегося ПЦР-продукта основывается на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определенной длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать.
Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).
Принцип метода флюоресцентной гибридизации in situ. Разработка флуоресцентных меток для клонированных проб ДНК явилась основой молекулярно-цитогенетического метода, названного FISH-метод – Fluorescence in situ hybridization. Метод позволяет объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные участки на цитологических препаратах в метафазных или интерфазных ядрах на основе особенностей их молекулярно-генетического строения.
Классический метод FISH-анализа основан на гибридизации известной по нуклеотидному составу ДНК-пробы с участком тестируемой хромосомы и последующим выявлением результата гибридизации по метке – флуоресцентному сигналу в ожидаемом участке. В качестве ДНК-пробы (ДНК-зонда) могут служить относительно небольшие фрагменты ДНК, комплементарные анализируемой последовательности хромосомной ДНК (мишени) больного. Размер проб может варьировать от 90–100 тысяч до нескольких миллионов пар нуклеотидов, так что мишенью могут служить не только отдельные гены или хромосомные участки, но и целая хромосома.
FISH анализ осуществляется в несколько этапов:
1. Для изучаемой хромосомы или ее конкретного участка (в связи со специфичностью последовательности оснований ДНК) готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой помеченный участок ДНК называется зондом.
2. На микроскопическом препарате in situ при обработке щелочью хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.
3. Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.
4. После этого препарат обрабатывают веществом, которое способно избирательно присоединиться к биотину или дигоксигенину. Для биотина это стрептовидин, для дигоксигенина - антидигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин - красный цвет или флюоресцеина изотиоцианат - зеленый цвет).
5. С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы можно увидеть на фоне неокрашенных.
Двойная специфическая флюоресценция гибридизации in situ.
1 - биотин; 2 - стрептовидин; 3 - родамин; l'-диоксигенин; 2'-антиди- гоксигениновое антитело; 3', 4'-флюоросцеина изотиоцианат.
По своей диагностической характеристике ДНК-пробы (зонды) подразделяются на несколько групп:
CEP – Chromosome Enumerator Probe, хромосомные нуменаторы или центромерные зонды;
SubTel – Subtelomere specific, субтеломерные зонды;
WCP – Whole Chromosome Painting, цельнохромосомные зонды;
mBand – High Resolution Multicolor Banding, зонды для определения внутрихромосомных перестроек;
LSI – Locus Specific Identificator, локус специфические Зонды
Центромерные пробы, и в меньшей степени, теломерные, широко используются в диагностике численных хромосомных нарушений (моносомии и трисомии). Наибольшее распространение эти пробы получили в пренатальной цитогенетической диагностике, особенно в исследованиях хориальной ткани, в ходе которых не всегда возможно получение качественных хромосомных препаратов или требуется быстрое цитогенетическое заключение при риске наличия распространенных хромосомных болезней, обусловленных нерасхождением хромосом. Остальные группы зондов востребованы для экспресс-диагностики с целью уточнения степени мозаицизма неделящихся клетках ворсин хориона и амниотической жидкости.
Метод FISH – чувствительный метод и для обнаружения цитогенетических отклонений уже на ранней стадии опухолевого преобразования клеток. Все большее распространение FISH зонды получают в диагностике и мониторинге лечения онкологических и онкогематологических заболеваний.
Микрочипирование. Биологические микрочипы – это набор молекул ДНК (реже – белков), упорядоченно размещенных на специальном носителе, так называемой «платформе». Платформой может служить пластинка из стекла, пластика, кремния, или полимерная мембрана. Размер диагностической поверхности микрочипа может варьировать от нескольких квадратных миллиметров до 50 квадратных сантиметров. На каждом микрочипе может располагаться от 30–50 до нескольких десятков и даже сотен тысяч упорядоченно нанесенных микротестов или проб. ДНК-пробы длиной от 25–30 до 200–1000 нуклеотидов могут быть нанесены на кремниевую, стеклянную, нитроцеллюлозную подложку, выращены на кварцевой подложке методом имульсионной фотолитографии или внесены в гель (в случае гелевых чипов). Принцип действия микрочипов основан на способности комплементарных оснований нуклеиновых кислот образовывать химические связи. Одна из комплементарных цепей ДНК (ДНК(проба), с известной последовательностью нуклеотидов, зафиксирована на «платформе» (подложке или пластине), а другая одноцепочечная ДНК(мишень (зонд), меченная флуоресцентной меткой, вносится в ДНК(чип. Наличие того или иного вещества или гена в образце определяют по люминесцентному свечению на прореагировавшем чипе. Анализ прореагировавших чипов производится автоматически с помощью специальной регистрирующей системы – анализатора (чип-детектора), который представляет собой либо флуоресцентный широкопольный микроскоп, либо специальное считывающее лазерное устройство, соединенные с видеокамерой и компьютером.