Эндофитные микроорганизмы – продуценты биологически активных веществ

Некоторые штаммы эндофитов, естественным образом колонизирующие иглы хвойных, продуцируют соединения или токсины, влияющие на выживаемость вредителей. Иглы колонизированных таким образом сеянцев содержат токсины, и скорость роста вредителей снижена, а чувствительность к паразитам и природным бактериальным патогенам увеличена [11].

Также обнаружено, что колонизация токсикогенным эндофитом персистирует и распространяется на неинокулированные новые выросшие ветви так, же как на соседние сеянцы [11].

Термин «токсикогенный», как применяют здесь, обозначает токсичный для насекомых-вредителей хвойных деревьев. «Токсикогенный» включает в себя токсичность против насекомых и против грибов. Термин «выделенный токсикогенный эндофит», как применяют здесь, обозначает выделенный штамм эндофита, продуцирующий токсин, который является токсичным для вредителя. Выделенный токсикогенный эндофит является способным колонизировать сеянцы хвойных и продуцировать токсин в колонизированном растении. Токсин, продуцированный токсикогенным эндофитом, придает увеличенную устойчивость к вредителям посредством контроля, снижения, уменьшения, предупреждения или отпугивания вредителей, и/или роста вредителей, и/или повреждения вредителей в колонизированном растении по сравнению с неколонизированным растением. штамм токсикогенного эндофита представляет собой токсикогенный штамм вида Phialocephala и является родственным Nemania serpens. Оба представляют собой виды Lophodermium.

Термин «окно времени  чувствительности» обозначает период времени, во время которого сеянец хвойного является чувствительным или восприимчивым  к колонизации при инокуляции композицией инокулята, содержащей токсикогенный эндофит. Окно времени чувствительности, необязательно, включает стадию стратификации семян и/или послевсходовый период непрерывного удлинения верхушки побега, когда кутикула еще не полностью сформирована.

Авторы изобретения обнаружили, что семена можно инокулировать во время стратификации семян. В одном варианте осуществления способ включает в себя замачивание семени хвойного в воде, содержащей инокулят, во время стратификации семян. В другом варианте осуществления семя хвойного белой ели замачивают в воде, содержащей инокулят, в течение ночи, высушивают, и еще влажное семя охлаждают при 2-6°C в течение приблизительно двух недель [11]. 

1.5 Современные технологии применения эндофитных микроорганизмов.

В экологически устойчивых агросистемах большое внимание уделяется активизации всех мутуалистических взаимосвязей между главными компонентами агроэкосистемы: сельскохозяйственными растениями и тесно связанным с ним сообществом микроорганизмов. Для взаимодействия с микроорганизмами растение предоставляет множество экологических ниш – поверхность тканей, межклеточные пространства, сосуды, клетки, – образуя специализированные структуры или обходясь без них, тратит на поддержание своих микропартнеров до 1/3 своих энергетических ресурсов. В результате микроорганизмы выполняют многие значимые для растения функции: обеспечивают их азотное и фосфорное питание, защиту от фитопатогенов и вредителей, адаптацию к стрессам и регуляцию развития. При искусственном отборе культурных растений на высоком фоне минеральных удобрений и химических средств защиты растений и многие природные механизмы поддержания мутуалистических отношений между макро- и микросимбионтами были утеряны. Использование эффективных микробно-растительных консорциумов позволило бы снизить химическую нагрузку на окружающую среду, минимизировать вклад антропогенной энергии в агроэкосистему и повысить качество сельскохозяйственной продукции [28].

Несмотря на то, что изучение эндофитных микроорганизмов во многом еще находится на стадии скрининговых исследований, уже ведутся разработки биопрепаратов на их основе. Вначале стимулирующие препараты были созданы из чистых культур эндофитов таких слабо микотрофных растений, как овес, пшеница, картофель и сильно микотрофного растения мать-и-мачеха.

Первые полевые опыты  установили отсутствие специфичности  их действия. На картофеле и пшенице  лучшие результаты были получены при  обработке посевного материала  не от одноименных препаратов, а  от эндофита наиболее сильно микотрофного растения. Дальнейшие исследования подтвердили значение препаратов, приготовленных из эндофитов наиболее сильно микотрофных растений. Так, получивший авторское свидетельство препарат «Симбионт 1» изготовляется из эндофита, выделенного из корней женьшеня. Второй препарат, изучение которого началось недавно, — «Симбионт 2» не уступает первому, но для его оформления нужно, чтобы он превосходил его [29].

Препарат «Симбионт 1»  содержит 12 количественно определяемых аминокислот и большое количество ауксинов, эффективное использование  которых требует разведения препарата  в 10 и 100 тысяч раз. Для обработки 3—4 тонн посадочного картофеля на 1 га нужно 1мл препарата развести в 10 литрах воды. Для зерновых культур  этим количеством обрабатывается зерно  на 3—4 га. Установлено эффективное  сочетание препарата с одновременным  применением любого микроэлемента  в концентрации его соли 0,02%.

Чем определяется положительное  действие стимулирующих препаратов, если эндофиты сами снабжают растение гормонами роста? С момента прорастания зерна, и в особенности клубня, до развития в их корнях эндофитов проходит много времени, в период которого растение испытывает недостаток ростовых веществ [30]. При обогащении или семени или клубня наблюдается значительное увеличение корневой системы наряду с повышением ее микотрофности. На этом, очевидно, заканчивается непосредственное действие препарата. Усиление роста растений и повышение их устойчивости к болезням является следствием указанных выше факторов [29].

В 80-х годах, при исследованиях  хлопчатника, было замечено, что на поле хлопчатника, пораженного фитофторозом, одни растения болеют и погибают, а другие, рядом с ними, здоровые. Это наблюдение послужило отправной точкой для создания биопрепарата. Начался отбор здоровых растений. В результате было изолировано более трехсот штаммов бактерий. Из всех штаммов из них отобрали 2 - 3 штамма, обладающие наибольшей активностью и необходимые для дальнейшей работы, и на основе этих штаммов, с помощью научного отдела НВП «БашИнком» был создан препарат Фитоспорин. В данный момент производятся две разновидности данного препарата: Фитоспорин-М, порошок для лечения грибных и бактериальных болезней, и Фитоспорин Реаниматор. Для обработки одной сотки посадок требуется 10 г Фитоспорниа-М, который является универсальным для всех овощей, фруктов на 10 литров воды. От болезней растений в тяжелом состоянии производитель рекомендует Фитоспорин Реаниматор, в котором выше концентрация полезных фитобактерий [31].

Другим современным биопрепаратом  является Актофит. Препарат высокоэффективен против вредителей сельскохояйственныйх культур, таких как колорадский жук, тля, растительные клещи, трипсы, капустная белянка, совки, плодожорки, яблочная моль, саранчо­вых и листоверток, долгоносиков, пилильщиков, боярышницы и других вредителей. Основное действующее вещество препарата - Абамектиновый комплекс группы авермектинов. Таким образом, при создании препарата Актофит применяются не сами эндофитные микроорганизмы, а их метаболиты. Продуцируются метаболиты непатогенным лучистым грибком – Streptomycesavermitilis. Авермектины - это естественные высокоспецифичные нейротоксины, которые в микродозах проникают в организм насекомых-вредителей кишечным или контактным путем и необратимо поражают их нервную систему. Отдельно следует отметить о наличии в инсектициде аминокислот, витаминов и биологически активных компонентов - продуктов жизнедеятельности почвенного грибка, которые играют роль естественных биостимуляторов роста и развития растений. Актофит прошел научные исследования и апробацию в аккредитованных научных учреждениях Украины: в Институте защиты растений УААН, Институте садоводства УААН, Институте сельского хозяйства Полесья УААН, в Институте винограда и вина «Магарач»; в Молдавском Научно-Исследовательском институте защиты растений, Пакистане, Ливии и Австрии [32].

Триходермин - препарат, содержащий споры и мицелий гриба-антагониста Trichoderma lignorum, а также продуцируемые грибом в процессе производственного культивирования биологически активные вещества. Гриб Trichoderma lignorum, подавляет развитие фитопатогенных микроорганизмов путем воздействия на них прямым паразитированием, конкуренцией за субстрат, выделением ферментов, антибиотиков (глиотоксин, виридин, триходермин и др.) и других биологически активных веществ, которые угнетают развитие многих видов возбудителей заболеваний, в том числе бактериальных, а также тормозят репродуктивную способность патогенов [33]. Рекомендуется для защиты растений от альтернариоза, аскохитоза, серой гнили, белой гнили, фузариоза, гельминтоспориоза, питиоза, фомоза, фитофтороза, вертициллеза [34].

Битоксибациллин - препарат кишечного действия, содержащий бактерии Bacilius Thuringiensis var. Thuringiensis, а также продуцируемые ими в процессе производственного культивирования белковые кристаллы б-эндотоксинa и р- экзотоксинa. Битоксибациллин вызывает угнетение секреции пищеварительных ферментов и нарушение функции кишечника вредителей, ингибирует питание, нарушает сроки метаморфоза, снижает плодовитость самок и жизнеспособность следующих поколений [34].

Препарат «Эмистим-С» был создан на основе вытяжки грибов-эндофитов из корней женьшеня и облепихи. Корни женьшеня и облепихи были выбраны не случайно – указанные растения обладают развитой корневой системой. С использованием грибов-эндофитов из корня облепихи был создан отдельный препарат «Симбионт». Некоторые виды эндофитных микромицетов этих растений совпадают с эндофитной флорой сахарной свеклы, чем объясняется положительное действие препаратов на урожайность этой культуры [29]. Недостатком препаратов группы «Симбионт» является то, что для выделения исходных эндофитных микромицетов требуется использование ценных лекарственных растений – облепихи и женьшеня. Другим недостатком является то, что препарат эффективен только при хороших условиях роста растений [29]. В качестве альтернативы этим препаратам был создан новый, экспериментальный продукт на основе эндофитных микромицетов, выделенных из корня лоха. Наиболее ярко выражена ростстимулирующая активность была отмечена у Mycelia sterilia. При культивировании штамма в течение 3-х недель в жидкой среде Гельцер с последующим выделением комплекса вторичных метоболитов полученный препарат увеличивает адсорбирующую поверхность злаковых культур на 30-70%, а также прирост гипокотиля экспериментальной линии горчицы 50-70% к контролю (воде) [35]. Цитокинины представляют собой наиболее активные природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток. Гибберелловая кислота ГА3 наиболее широко применяется в сельском хозяйстве как регулятор роста растений. Однако ГА7 представляет наибольший интерес, т.к. имеет более широкий спектр действия и физиологическую активность выше. Индолилуксусная кислота (ИУК) является ростстимулятором, но из-за плохой растворимости в воде и относительно высокой стоимости имеет узкий спектр рекомендованых для обработки культур [36]. Заявляемый штамм позволил получить одновременно все эти соединения, что значительно повысило биологическую активность препарата и одновременно повысило экономическую эффективность его применения. В препарате содержатся следующие аминокислоты: лизин - 0,055, гистидин - 0,024, аспарагин - 0,005, серин - 0,096, глутамин - 0,025, глицин - 0,031, аланин - 0,040, валин - 0,061. Положительное влияние препарата было отмечено для следующих растений: сеянцы ели колючей, капуста, картофель, томаты, огурцы. Также проведены исследования штамма Mycelia sterilia, подтвердившие его непатогенность в отношении растений и животных [35].

Однако исследования пошли  дальше подбора микромицетов. На основе уже полученных данных был создан биопрепарат «Сизам». Принцип его действия заключается в стимулировании эндофитных микромицетов, уже имеющихся в растении. Основной препарат состоит из сульфатов и различных солей меди, кобальта, марганца, цинка, железа и бора. Препарат наносится на гомеопатические гранулы. Таким образом, стимулируется работа грибов-эндофитов по продуцированию необходимых ему фитогормонов и других физиологически активных веществ. Микроэлементы подобраны так, чтобы они улучшали функциональную деятельность эндофитов растений по продуцированию биологически активных веществ, жизненно необходимых данному виду растения. Эти вещества, способствуя гармонизации процесса развития растений, повышают всхожесть семян, а также обеспечивают условия для мощной корневой системы, рост самого растения, кущение злаков, утолщение стеблей, формирование большей ассимиляционной поверхности и закладку необходимого количества генеративных органов. При этом повышается устойчивость растений к неблагоприятным условиям (засухе или заморозкам) и болезням. «Сизам» применяют для обработки семян перед посевной, а это дает значительную экономию различных ресурсов [37].

В данный момент ведется  разработка препарата «Мицефит». В результате исследований был получен новый штамм эндофитного микромицета, комплекс метаболитов которого оказывает выраженное стимулирующее действие на рост и развитие растений. Определена видовая принадлежность микромицета, который отнесен к Phialocephala fortinii F-833. Проведены испытания по обработке семян различных зерновых культур (пшеница, ячмень, просо, подсолнечник, мятлик, райграс) путём замачивания в фильтрате КЖ Phialocephala fortinii F-833 при разведении 10-5 см3/см3. Контрольные варианты семян замачивали в стерильной водопроводной воде. Отмечено значительное улучшение всхожести семян, увеличение биомассы побегов и корней по сравнению с контрольными образцами. Лиофильно высушенная форма различных органических веществ обеспечивает наибольшее удобство хранения, транспортировки и применения потребителями. Поэтому для получения готовой формы препарата применяли метод сублимационного высушивания во флаконах. Сухой продукт представляет собой чрезвычайно пористый слой белого цвета, хорошо сохраняющий первоначальную форму замороженного продукта и исходную биологическую активность. Была проверена биологическая активность препарата при более длительном сроке хранения в течение 3 лет. Обработка препаратом повышала всхожесть семян рапса на 32,6%. Препарат увеличивал длину стеблей рапса во всех испытанных разведениях на 6,1-22,6% и длину корней на 32,4-97,1%. На основе экспериментально полученных данных определен расход препарата: 1 г сухого препарата (1,7 м3 рабочего раствора) достаточно для замачивания 3,4 т семян или опрыскивания 1,7 га посадок [37].

Таким же эффективным биостимулятором  роста растений является Эндофит-L1, применяемый как совместно с пестицидами, так и отдельно. Высокоэффективный препарат, продукт биотехнологического выращивания нового штамма грибов корней женьшеня, содержит продукты метаболизма: ауксины, цитокинины, гибберилины, ненасыщенные жирные кислоты, витамины (преимущественно группы В), аминокислоты, ферменты, липиды, филоксины, пигменты и другие физиологические вещества, которые в первую очередь стимулируют развитие корневой системы, а в последствии обеспечивают сбалансированное питание с/х культур [38]. Проводились исследования, сравнивающие влияние различных биопрепаратов на всхожесть и урожайность различных сортов пшеницы. Лучшим среди препаратов был эндофит L1 при всех способах применения, среди которых инокуляция семян и опрыскивание во время кущения. Хотя регуляторы роста Реаком-СР-Зерно и Реастим-Зерно и обеспечивали повышение урожая и получение надбавок, но с экономической точки зрения их использования не всегда было выгодно, потому приводило к значительному увеличению затрат на производство семян и снижению рентабельности. Объясняется это прежде всего значительным количеством препарата (8 л), которую используют на одну тонну семян или на гектар посева, и его стоимостью [39]. На основе эндофит L1 в последствии был создан препарат «Марс-L» [38].

Препарат Экстрасол применяется при выращивании картофеля. В процессе исследований влияния экстрасола на продуктивность картофеля,   зафиксированных в актах производственных испытаний,  выявлены положительные антифунгальные и антибактериальные эффекты.  В 12   регионах РФ доказано подавление фитофтороза,  макроспориоза,   поражение клубней серой гнилью,  ризоктониозом,  бактериозами. Биологическая эффективность экстрасола составила от 71 до 93%. Применение экстрасола позволяет решить не только проблему стимуляции роста растений и подавления роста патогенной фитофторы, но и проблему последующей утилизации пожнивных остатков [40]. Введение в агроценоз биопрепаратов позволяет управлять многостадийным микробиологическим процессом «биодеструкция +  гумификация» [41]. Создана устойчивая к химическому загрязнению почв композиция штаммов для быстрой биоутилизации пожнивных остатков.  При использовании биопрепаратов со стартовым азотным питанием выявлено значимое усложнение микробиоты в пахотном горизонте.  Общее количество бактерий в варианте с экстрасолом выросло на 72%,  гуматмодификаторов – на 154%, амилолитических бактерий – на 90%, протеолитов – на 90%,  микромицетов – на 111%. Исследования показали  зависимость урожайности и качества получаемой продукции от стрессовых климатических условий года. Биопрепараты «снимают» химические ожоги после пестицидных обработок,  на 2-3  недели продляют срок жизни растений в условиях крайней засухи.  Экстрасол оказался абсолютно незаменим для спасения урожая в экстремальных климатических условиях при недостаточном обеспечении растений комплексом элементов минерального питания [40].