Гормональная регуляция вторичного метаболизма в культурах in vitro лекарственных растений

 

 

 

 

 

 

 

Реферат на тему:

 

«Гормональная регуляция вторичного метаболизма в культурах in vitro лекарственных растений»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

 

Введение …………………………………………………………………………3

Обзор литературы

1.Вторичные метаболиты и их продуценты.…...………………………....…...4

2. Гормональная регуляция вторичного метаболизма….....………..………....7

Выводы…………………………………………………………………………..12

Список использованных источников………………………….…………........13

 

 

 Введение

 

Многие из промышленно важных соединений в настоящее время используемых в фармацевтической, пищевой и парфюмерной промышленности, выделяют из тканей возделываемых или дикорастущих растений, часто принадлежащих к редким видам. В связи с этим идет активный поиск новых альтернативных источников получения биологически активных веществ растительного происхождения. Одним из таких источников являются культуры клеток растений достоинства использования которых для получения биологически активных веществ (БАВ) широко признаны в настоящее время. Культуры клеток и тканей, полученные in vitro, как и клетки интактного (целого) растения, могут синтезировать вторичные метаболиты (ВМ), имеющие большое практическое значение.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обзор Литературы

1. Вторичные  метаболиты и их продуценты

Природное растительное сырье обладает существенным спектром биологической активности и мягким действием. Данные позиции являются преимуществами фармакологических препаратов из природного растительного сырья. На сегодняшний день из растений получают более трети всех лекарственных средств, используемых в медицинской практике. Структура многих из них очень сложна в связи с этим растения еще долго будут единственным источником получения лекарственных субстанций [1]. Целебное действие лекарственных растений обусловлено присутствием в них биологически активных веществ, относящихся обычно к продуктам специализированного (вторичного) обмена [2]. В настоящее время известно более 100 000 ВМ, продуцируемых растениями. Многие из них являются практически важными продуктами. Однако в настоящее время в биосфере насчитывается 6 млн. индивидуальных химических соединений, которые тем или иным путем могут попадать и накапливаться в растениях [3]. Поэтому альтернативным источником получения экологически безопасных лекарственных субстанций является культура растительных клеток и тканей in vitro [4-5].

Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать  традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать  принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений.

Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов является низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме «сверхзадачей». Актуальным при использовании культур тканей и клеток высших растений с целью получения ценных вторичных метаболитов является поиск условий, при которых обеспечивался бы оптимальный рост и оптимальное содержание целевого продукта в биомассе.

К настоящему времени разработан целый  ряд стратегий для повышения  продукции вторичных метаболитов  культивируемыми in vitro растительными клетками и тканями: создание продукционных питательных сред, оптимизация физических условий культивирования, добавление предшественников вторичных метаболитов, иммобилизация клеток, индуцированный мутагенез и клеточная селекция in vitro. Благодаря им получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем.

В данном реферате хотелось бы более подробно рассмотреть гормональную регуляцию вторичного метаболизма.

В качестве продуцентов  вторичных метаболитов рассмотрим важные и ценные лекарственные растения, а именно: эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea), расторопша пятнистая (Sylibum marianum),сирень обыкновенная (Syringa vulgaris),шалфей лекарственный (Salvia officinalis),каллизия душистая (Callisia fragrans),пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum),                            

катарантус розовый (Сatharanthus roseus ),барвинок малый (Vinca minor).

Эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea) хорошо известна как прекрасный иммуностимулятор. К основным классам БАВ данного растения относятся водорастворимые полисахариды, гидроксикоричные кислоты и их производные, флавоноиды и др. [6].

Среди фенольных соединений шалфея лекарственного (Salvia officinalis) доминируют фенолкарбоновые кислоты и их производные (хлорогеновая, розмариновая и др.), обладающие антиоксидантным, нейропротеторным, противирусным, гепатопротекторным действиями [7].

Расторопша пятнистая (Sylibum marianum) обладает выраженными гепатопротекторными свойствами благодаря высокому содержанию флаволигнанов (силибина, силикристина, силидианина) – уникальных соединений группы фенилпропаноидов [8].

Сирень обыкновенная (Syringa vulgaris) также содержит разнообразные соединения, обладающие адаптогенными, иммуномодулирующими и противораковыми свойствами, которые уже многие годы привлекают внимание различных исследователей [9].

Лечебные свойства каллизии душистой (Callisia fragrans) объясняются наличием в химическом составе этого растения биологически активных веществ из группы флавоноидов (кверцетин и кемпферол) и растительных стероидов. В соке найдены витамины С, РР, B₁₂ и микроэлементы Fe, Cr, Ni, Cu. Каллизию используют для лечения ожогов, туберкулеза, артрита, бронхиальной астмы, бесплодия, кожных онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Препараты, приготовленные из листьев и побегов каллизии душистой, подавляют патогенную микрофлору в кишечнике, облегчают боль, восстанавливают функцию поджелудочной железы, селезенки, устраняют воспаление [10].

Пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum) как лекарственное растение включено в ряд европейских и других фармакопей. Официально признано, что экстракты семян обладают антиоксидантным, противовоспалительным, антихолестериновым, антианемическим, антидиабетическим и другими терапевтическими эффектами. Фитохимические исследования семян свидетельствуют о присутствии в них алкалоида тригонеллина, стероидных сапогенинов, таких как диосгенин, ямогенин, гитогенин и др. [11], флавоноидов (витексина, ориентина, изоветиксина, лютеолина, кемпферола, кверцетина) [12].

Из различных частей растения катарантуса розового (Сatharanthus roseus) выделяют более 100 алкалоидов, производных индола. Особый интерес представляют алкалоиды винбластин, винкристин, катарантин, аймалицин, виндолин, которые широко используются для комплексной терапии некоторых форм онкологических заболеваний и лечении диабета. Некоторые алкалоиды, содержащиеся в данном растении (например, резерпин, серпентин), являются транквилизаторами. Кроме алкалоидов в различных тканях катарантуса присутствуют стероиды, фенольные соединения, антоцианы, жирные кислоты и другие метаболиты, обеспечивающие антиоксидантные и противовоспалительные эффекты [13].

Барвинок малый (Vinca minor) является менее изученным по сравнению с катарантусом розовым. Однако в его составе также обнаружены алкалоиды индольного ряда, флавоноиды, стероиды, органические кислоты и др. соединения. Препараты барвинка малого понижают артериальное давление, расширяют венечные сосуды сердца и сосуды головного мозга. Основной алкалоид растения – винкамин – улучшает мозговое кровообращение и утилизацию кислорода тканями мозга. Лекарственные препараты, содержащие сумму алкалоидов барвинка, применяют при спазмах сосудов мозга, гипертонической болезни, неврогенной тахикардии, головных болях различного происхождения, а также при депрессивных состояниях [14].

Таким образом, представленные виды лекарственных растений характеризуются  разнообразием фармакологических  эффектов и содержат различающиеся  по химической структуре и физико-химическим свойствам группы вторичных метаболитов. Поскольку большинство из них не имеют естественных ареалов произрастания на территории Беларуси, то большой практический интерес представляет возможность их культивирования в искусственных условиях in vitro.

 

2. Гормональная регуляция  вторичного метаболизма

Фитогормоны способны эффективно регулировать и первичный, и вторичный метаболизмы клеток. Широко применяемым ауксином является 2,4-Д, способен стимулировать как деление, так и растяжение клеток. Однако может вызывать резкое подавление синтеза продуктов вторичного метаболизма.

Наряду с 2,4-Д α-нафтилуксусная кислота (НУК) также широко используется при  культивировании растительных объектов в условиях in vitro. Характер влияния данного синтетического ауксина на образование продуктов вторичного метаболизма в клеточных культурах может значительно отличаться от воздействия 2,4-Д и заключаться в стимуляции их биосинтетического потенциала

Положительный эффект НУК на синтез вторичных метаболитов может быть связан с индукцией процессов цитодифференцировки  в отличие  от  2,4-Д, который в большинстве случаев используется для получения клеточных культур и поддержания их активного роста, поскольку способствует переходу клеток экспланта в дедифференцированное состояние, что является необходимым этапом индукции каллусогенеза. Присутствие данного регулятора в питательной среде обеспечивает стабильный рост клеточных культур, поддержанию их дедифференцированного состояния, что делает их похожими на меристематические клетки, а также ингибирование активности многих ферментов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов.

Влияние фитогормонов на синтез вторичных метаболитов в  культуре in vitro реализуется посредством следующих основных механизмов:

1) модификация активности  ферментов (например, повышение активности  никотиндеметилазы под действием  НУК, и ингибирирование целого  ряда ферментов, катализирующих  образование фенольных соединений  под действием 2,4-Д);

2) регуляция транскрипции  генов, ответственных за синтез вторичных метаболитов.

Показано, что в экспериментах при культивировании растительных объектов in vitro в качестве основы обычно используется среда Мурасиге и Скуга [15], которая дает хорошие результаты при каллусообразовании и эффективно поддерживает неорганизованный каллусный рост. Вариации касаются содержания представителей двух групп регуляторов роста – ауксинов и цитокининов, присутствие которых абсолютно необходимо для индукции дедифференциаиции и каллусогенеза.

В качестве ауксинов для получения и поддержания культур тканей используются β-индолил-3-уксусная кислота (ИУК), α-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). В качестве источников цитокининов в питательных средах использовали кинетин и 6-бензиламинопурин (БАП).

Технология получения  каллусной и суспензионной культур  сводится к следующему. На первом этапе  были отобраны экспланты для введения в культуру. Поскольку проращивание простерилизованных семян в асептических условиях часто дает наиболее пригодный материал для получения каллусов, то источником эксплантов при введении в культуру in vitro таких лекарственных растений как эхинацея пурпурная, шалфей лекарственный, расторопша пятнистая, катарантус розовый, барвинок малый в настоящей работе служили именно асептически выращенные 3-4 недельные их проростки.

Несмотря на то, что  каллусные клетки представляют собой  основной объект при длительном культивировании in vitro, биотехнологическое получение экономически важных фармакологически активных веществ в настоящее время основано на суспензионной культуре. Это связано с тем, что она характеризуется более высокой скоростью роста, более широкими возможностями для изучения влияния экзогенных факторов на метаболизм и рост клеток, а также благодаря простоте процессов субкультивирования позволяет осуществлять технологический процесс на основе использования биореакторов [16].

Широко применяемым  ауксином является 2,4-Д, способный стимулировать  как деление, так и растяжение клеток. Однако он может вызывать резкое подавление синтеза продуктов вторичного метаболизма. На примере каллусной культуры шалфея лекарственного было установлено, что повышение концентрации 2,4-Д в питательной среде сопровождается более активным приростом клеточной биомассы и снижением уровня фенолкарбоновых кислот .

Включение же в состав питательной среды НУК в качестве ауксина в концентрациях от 0,2 до 1,0 мг/л способствовало значительному возрастанию содержания фенолкарбоновых кислот в исследуемой каллусной культуре. Присутствие данного регулятора в питательной среде обеспечивает стабильный рост клеточных культур, поддержание их дедифференцированного состояния, а также ингибирование активности многих ферментов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов.

Таким образом, 2,4-Д лишь поддерживает пролиферацию клеток in vitro, а для начала индукции синтеза многих ВМ требуется замедление роста культуры и присутствие в питательной среде НУК (либо ИУК), которые способны запускать процессы клеточной дифференцировки [17].

Поскольку содержание практически важных ВМ в высших растениях часто определяется активностью синтеза и уровнем накопления их предшественников, на примере экстракта каллусных линий растений семейства Apocynaceae на стационарной фазе роста было показано содержание L-триптофана. L-триптофан является первичным предшественником всех индольных алкалоидов, в том числе, и винкамина – основных алкалоидов барвинка малого и катарантуса розового.В проведенных экспериментах было показано наибольшее содержание L-триптофана в экстрактах каллуса, культивируемого на среде, содержащей 1мг/л кинетина и 1 мг/л НУК. В экстрактах каллуса, культивируемого на среде с пониженным содержанием НУК, L-триптофана было меньше на 15%, на среде, содержащей 2,4-Д – на 20%. Таким образом, уменьшение содержания НУК в среде культивирования, и замена НУК на 2,4-Д приводит и к уменьшению накопления биомассы, и к снижению содержания L-триптофана.