Генные мутации

Пример 1. Замена аминокислотного остатка в составе полипептида (миссенс–мутации). В состав молекулы гемоглобина человека входят две a-цепи (a-цепь закодирована в 16-ой хромосоме) и две b-цепи (b-цепь закодирована в 11-ой хромосоме). В состав b-цепи входит 146 аминокислотных остатков, при этом в нормальной b–цепи шестым аминокислотным остатком является глутаминовая кислота. С участием нормальной b-цепи образуется нормальный гемоглобин – HbA. В нетранскрибируемой нити участка ДНК, кодирующего b-цепь, глутаминовая кислота закодирована триплетом ГАА. Если же в результате мутации в ДНК произойдет замена триплета ГАА на триплет ГТА, то на месте глутаминовой кислоты в молекуле гемоглобина в соответствии с генетическим кодом появится валин. В итоге вместо гемоглобина HbA появится новый гемоглобин – HbS. Такая замена всего лишь одного нуклеотида и одной аминокислоты приводит к развитию тяжелого заболевания – серповидноклеточной анемии.

На клеточном уровне серповидноклеточная анемия проявляется в том, что при гипоксии (недостатке кислорода) эритроциты приобретают форму серпа и теряют способность к нормальному транспорту кислорода. Гомозиготы HbS/HbS умирают в раннем детстве. Зато гетерозиготы HbA/HbS характеризуются слабо измененными эритроцитами. При этом изменение формы эритроцитов значительно повышает устойчивость гетерозигот к малярии. Поэтому в тех регионах Земли, где свирепствует малярия (например, в Африке), отбор действовал в пользу гетерозигот. Таким образом, серповидноклеточная анемия – это пример относительности  «полезности» и «вредности» мутаций.  

Пример 2. Мутация без замены аминокислотного остатка в составе полипептида (сеймсенс-мутации). Если в нетранскрибируемой нити участка ДНК кодирующего b–цепь гемоглобина, произойдет замена триплета ГАА на триплет ГАГ, то из-за избыточности генетического кода замены глутаминовой кислоты не произойдет. В итоге структура b–цепи гемоглобина не изменится, и в эритроцитах будет обнаруживаться только нормальный гемоглобин HbA. Таким образом, вовсе не любая генная мутация проявляется в фенотипе.

Особую группу образуют ликовые мутации, в результате которых происходит незначительное изменение характеристик конечного продукта. Это связано с заменой аминокислотных остатков в пассивной части белка: такие замены не оказывают существенного влияния на структуру и функции белка.  

Мутации со сдвигом рамки считывания (фреймшифты) происходят в результате вставки или потери нуклеотидных пар, при этом общая длина ДНК изменяется. В результате происходит полное изменение структуры белка.

Однако если после вставки  пары нуклеотидов происходит потеря пары нуклеотидов (или наоборот), то аминокислотный состав белков может  восстановиться. Тогда две мутации  хотя бы частично компенсируют друг друга. Это явление называется внутригенной супрессией.  

Рис!!!

Мутации со сдвигом рамки считывания составляют ~ 80% от всех генных мутаций. Вставки иначе называются инсерциями, а потери – эксцизиями. Процесс образования вставок называется инсерционным мутагенезом. Инсерционный мутагенез необходимо учитывать в генной инженерии.   

Нонсенс–мутации. Особую группу генных мутаций составляют нонсенс-мутации с появлением стоп-кодонов (замена смыслового кодона на стоп-кодон). Нонсенс-мутации могут возникать как вследствие замен нуклеотидных пар, так и с потерями или вставками. С появление стоп-кодонов синтез полипептида вообще обрывается. В результате могут возникать нуль-аллели, которым не соответствует ни один белок. Соответственно, возможно и обратное явление: замена нонсенс-кодона на смысловой кодон. Тогда длина полипептида может увеличиваться.

Дополнение 1. Существуют особые мутации, влияющие на экспрессию генов у эукариот

1. Мутации, изменяющие степень компактизации ДНК. В гигантских политенных хромосомах и в хромосомах типа ламповых щеток описаны мутации, инактивирующие ген, расположенный в каком-либо одном участке ДНК, т.е. блокирующие декомпактизацию хроматина. Скрещивание гетерозигот по таким регуляторным мутациям в F₂ дает расщепление 3:1, указывая на то, что они затрагивают единичные менделирующие факторы.

2. Гомеозисные мутации. Изменяют  порядок экспрессии генов. Фенотипический  эффект гомеозисных мутаций заключается в превращении одних органов в другие. Например, у мушки дрозофилы мутация группы bithorax, контролирующих развитие грудных и брюшных сегментов у дрозофилы, может приводить к появлению крылоподобных образований вместо галтеров; мутации группы antennapedia выражаются в том, что у насекомых на месте антенн вырастают ножки; мутации ophthalmoptera – развитие крыла из имагинального диска глаза; мутации proboscipedia – развитие ноги или части антенны (в зависимости от температуры) вместо хоботка; у мутантов tumorous head ткани головы замещаются другими типами тканей, включая структуры, характерные для гениталий. 

Дополнение 2. Некоторые мутации обладают плейотропным действием, т.е. приводят к изменению сразу нескольких признаков.

Пример 1. Ароматические аминокислоты – триптофан, фенилаланин, тирозин – образуются из хоризмовой кислоты. Если некоторая  мутация заблокирует хотя бы один этап синтеза хоризмовой кислоты, то клетка (организм) утрачивает способность к синтезу сразу трех аминокислот.

Пример 2. Один и тот же фермент (трансаминаза) контролирует синтез валина (из α–кетоизовалериановой кислоты) и изолейцина (из α–кето–β–метилвалериановой кислоты). Если некоторая мутация нарушит функции этого фермента, то клетка (организм) утрачивает способность к синтезу сразу двух аминокислот.

Пример 3. Один и тот же полипептид (продукт экспрессии одного гена) может входить в состав разных ферментов. Например, белок-апофермент липоатдегидрогеназы кишечной палочки в качестве субъединицы входит в состав других ферментов: пируватдегидрогеназы, 2-оксоглутаратдегидрогеназы, глицинового расщепляющего комплекса. Тогда мутация в гене LDH скажется на активности всех перечисленных ферментов.  

Дополнение 3. Мутация в одном гене может подавлять мутации, происходящие в других (неаллельных) генах. Это явление называется межгенной супрессией.  

Методы выявления генных мутаций  

Сложность выявления генных мутаций  связана, во-первых, с рецессивностью большинства мутаций (вероятность  их фенотипического проявления ничтожно мала), а во вторых с летальностью многих из них (мутанты не выживают).

Все множество методов выявления  генных мутаций можно разделить  на две группы: методы генетического  анализа и биохимические методы.  

1. Методы генетического анализа основаны на скрещивании возможных носителей мутации с тестерными линиями (линиями-анализаторами). Самый простой метод – это скрещивание носителей предполагаемой мутации с соответствующей рецессивно-гомозиготной линией, т.е. обычное анализирующее скрещивание.

Однако этот метод не позволяет  выявить неизвестные мутации, а  также летальные мутации. Поэтому создаются специальные тестерные линии для учета летальных мутаций.  

Например, у мушки дрозофилы  синтезирована тестерная линия М–5 (Мёллер–5), которая характеризуется особой структурой X–хромосом у самок. В этих хромосомах имеются аллели с определенным фенотипическим  проявлением (доминантный аллель B – полосковидные глаза; рецессивный аллель w^a – абрикосовые глаза; кроме того, имеется еще один аллель – sc, контролирующий отсутствие щетинок, но он в анализе обычно не учитывается). В хромосомах М–5 изменен порядок генов: имеется одна большая инверсия и одна малая, расположенная внутри большой (инверсии будут рассмотрены ниже); такое строение хромосом исключает появление кроссоверных особей при скрещивании мушек М–5 с другими линиями.

Для выявления мутаций используются самцы дикого типа – с нормальными X–хромосомами (аллели В⁺ и w⁺ – нормальные красные глаза, sc⁺  – нормальные щетинки; нормальный порядок генов). Эти самцы подвергаются обработке мутагенами (факторами, повышающими частоту мутаций). В результате в их половых клетках часть X–хромосом мутирует, т.е. в них возникают мутации. Обработанные самцы скрещиваются с самками М–5. В первом поколении (F1) все самки имеют полосковидные темно-красные глаза, а самцы – абрикосовые полосковидные глаза. Кроме того, часть самок получает от отцов по нормальный X–хромосоме, а часть – по мутантной X–хромосоме. Все самцы получают от матерей М–5 только немутантные хромосомы с аллелями В и w^a. В F1 рецессивные мутации у самок, даже если они есть, не дают летального эффекта, поскольку они находятся в гетерозиготном состоянии: мутантная X–хромосома дикого типа от отца сочетается с немутантной М–5–хромосомой от матери. 

Затем гибриды первого поколения  скрещиваются между собой, и потомство  каждой самки выращивается отдельно. Часть самок несет немутантную X–хромосому дикого типа, и в их потомстве обнаруживаются немутантные самцы дикого типа. Однако некоторая часть самок несет мутантную X–хромосому дикого типа с летальной мутацией; соответственно их сыновья, получившие такие хромосомы, не выживают, и самцы дикого типа в потомстве самок–носительниц не обнаруживаются.

         Ниже приведены схемы скрещивания, иллюстрирующие принцип использования метода Мёллер–5 (символом l обозначены летальные мутации).   

В настоящее время, кроме тестерной линии М–5 используются и другие тестерные лини мушек дрозофил и других модельных объектов. Например, существуют тест-системы, позволяющие выявлять мутации X-хромосомах самцов в первом же поколении, а также мутации в аутосомах. Применение этих линий позволяет изучать закономерности мутационного процесса, однако классический генетический анализ далеко не всегда можно использовать для выявления мутаций в популяциях человека и многих других организмов.

2. Биохимические методы выявления мутаций исключительно разнообразны и основаны на применении различных методик.

а). Методики, основанные на выявлении определенных биохимических продуктов мутантных генов. Легче всего выявлять мутации по изменению активности ферментов или по утрате какого-либо биохимического признака. Например, у микроорганизмов на селективных питательных средах выявляются ауксотрофные формы, не способные синтезировать определенные вещества (по сравнению с нормальными, прототрофными формами).

б).  Методики, основанные на непосредственном выявлении измененных нуклеиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с другими методиками (блот-гибридизации, авторадиографии). 

4. Общие закономерности  мутационного процесса. Механизмы  возникновения генных мутаций 

Причины возникновения мутаций

По причинам возникновения различают  спонтанные и индуцированные мутации.  

Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают без видимых причин. Эти мутации иногда рассматривают как ошибки трех Р: процессов репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Это означает, что процесс возникновения новых мутаций находится под генетическим контролем организма. Например, известны мутации, которые повышают или понижают частоту других мутаций; следовательно, существуют гены-мутаторы и гены-антимутаторы.

В то же время, частота спонтанных мутаций зависит и от состояния  клетки (организма). Например, в условиях стресса частота мутаций может  повышаться.  

Индуцированные мутации возникают под действием мутагенов.

Мутагены –  это разнообразные факторы, которые повышают частоту мутаций.

Впервые индуцированные мутации были получены отечественными генетиками Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым в 1925 г. при  облучении дрожжей излучением радия.

Различают несколько классов мутагенов:

–  Физические мутагены: ионизирующие излучения, тепловое излучение, ультрафиолетовое излучение.

–  Химические мутагены: аналоги азотистых оснований (например, 5-бромурацил), альдегиды, нитриты, метилирующие агенты, гидроксиламин, ионы тяжелых металлов, некоторые лекарственные препараты и средства защиты растений.

–  Биологические мутагены: чистая ДНК, вирусы, антивирусные вакцины.

–  Аутомутагены – промежуточные продукты обмена веществ (интермедиаты). Например, этиловый спирт сам по себе мутагеном не является. Однако в организме человека он окисляется до ацетальдегида, а это вещество уже является мутагеном.

 

 Общие закономерности мутагенеза

Мутации возникают не мгновенно. Вначале  под воздействием мутагенов возникает предмутационное состояние клетки. Различные репарационные системы стремятся устранить это состояние, и тогда мутация не реализуется. Основу репарационных систем составляют различные ферменты, закодированные в генотипе клетки (организма). Таким образом, мутагенез находится под генетическим контролем клетки; это – не физико-химический, а биологический процесс.

Например, ферментные системы репарации  вырезают поврежденный участок ДНК, если повреждена только одна нить (эту  операцию выполняют ферменты эндонуклеазы), затем вновь достраивается участок ДНК, комплементарный по отношению к сохранившейся нити (эту операцию выполняют ДНК-полимеразы), затем восстановленный участок сшивается с концами нити, оставшимися после вырезания поврежденного участка (эту операцию выполняют лигазы).

Существуют и более тонкие механизмы  репарации. Например, при утрате азотистого основания в нуклеотиде происходит его прямое встраивание (это касается аденина и гуанина); метильная группа может просто отщепляться; однонитевые разрывы сшиваются. В некоторых случаях действуют более сложные, малоизученные системы репарации, например, при повреждении обеих нитей ДНК.

Однако при большом числе  повреждений ДНК они могут  стать необратимыми. Это связано  с тем, что: во-первых, репарационные  системы могут просто не успевать исправлять повреждения, а во-вторых, могут повреждаться сами ферменты систем репарации, необратимые повреждения ДНК приводят к появлению мутаций – стойких изменений наследственной информации.