Генная инженерия

Содержание

Введение

Генная инженерия – совокупность методов, позволяющих путём операций in vitro (в пробирке) переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать наследственные признаки одних организмов другим. Генетическая инженерия – удивительное явление в науке, когда разработка новой методологии даёт мощный импульс развитию нашего понимания окружающей природы, её сокровенных глубин.

После открытия ДНК как носителя генетической информации прямые манипуляции  с генетическим материалом оказались в центре внимания исследователей, особенно после того как стали известны структурные детали генов и соответствующие им функции. Биохимические средства точного расчленения и воссоединения молекул ДНК сделали возможным манипулирование генами с перераспределением генов из одного источника в другой. Генно-инженерные исследования вносят уникальный вклад в изучение структурно-функциональной организации геномов различных организмов. Методы генетической инженерии постоянно совершенствуются, и всё больше исследователей используют её при расширении самых разных задач биологии.

В настоящее время  генная инженерия развивается как  наука. Открытия в этой области помогли  многим людям избавиться от своих  болезней, созданы новые сорта  растений.

Я выбрала эту тему реферата, потому что  думаю, что генетическая инженерия  занимает почётное место в перечне  наук, а её открытия играют важную роль в жизни многих людей. Эта наука  и её достижения сейчас очень актуальны, так как люди сегодня подвержены заболеваниям различного рода и нуждаются в эффективных лечебных препаратах. Различные сферы деятельности современного человека так или иначе связаны с генетической инженерией: медицина, сельское хозяйство, промышленность.

Цель моего реферата – раскрыть сущность генной инженерии, описать её основные методы и достижения.

Цели и задачи генной инженерии.

Генетическую инженерию составляет система экспериментальных приёмов, позволяющих конструировать лабораторным путём искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинативных молекул ДНК. Суть генетической инженерии сводится к перемещению отдельных генов из одного генетического окружения в другое, что приводит к различным фенотипическим изменениям клетки.

Цель  генной инженерии – получение  клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые белки, свойственные человеку. Достижение этой цели поможет избавить человечество от многих болезней, от которых в настоящее время нет лекарств. Этот процесс уже начался и принёс первые положительные результаты.

Технология  клонирования открывает возможности, которые представлялись немыслимыми  всего лишь несколько лет назад. С критической точки зрения эксперименты такого типа поднимают вопросы этического плана и вопросы о возможном спектре манипуляций с генами человека. С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК человека или другого высшего организма. Это позволяет изучить первичную структуру клонированного фрагмента, что приближает нас к пониманию организации структуры хромосомы. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм регулирующий транскрипцию этого гена, а также наработать нужный белок в том количестве, которое требуется для медицинских или исследовательских целей. Кроме того, клонированный участок ДНК одного организма можно ввести в клетки другого организма. Уже предпринимаются попытки вводить в те или иные культурные растения гены, обеспечивающие устойчивость к ряду болезней. Не за горами вмешательство в наследственную программу, полученную ребёнком от родителя. Станет возможным введение в зародыш на ранних этапах его развития каких-либо недостающих генов и тем самым избавление людей от страданий, вызываемых генетическими болезнями.

Сегодня накапливаются клонированные фрагменты  ДНК человека, ряда сельскохозяйственных животных и растений. Коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов. Для  полной библиотеки генома человека требуется  получить около 800 тысяч разных клонов. Процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован.

Достижение  всех этих возможных перспектив и  является задачей генной инженерии.

Строение и функции молекулы ДНК.

Главным объектом генно-инженерного  воздействия является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

ДНК является полимером  нуклеотидов. Нуклеотид состоит  из трёх компонентов: пуринового или  пиримидинового основания, пятиуглеродного  циклического сахара, с которым основание  связано одним из своих атомов азота N-гликозидной связью (образуется нуклеозид), и фосфата, связанного эфирной связью с углеродом сахара. К этим основаниям относятся два пурина (Pu) – аденин (А) и гуанин (G) – и два пиримидина  (Py) – тимин (Т) и цитозин (С).

Характерной особенностью ДНК является то, что её молекула состоит из двух полимерных цепей, закрученных в двойную спираль. Каждая цепь – это регулярный полимер, в котором остатки сахара двух соседних нуклеотидов связаны при помощи фосфатных групп. В образовании этой связи всегда принимают участие 5-фосфат одного нуклеотида и 3-гидроксил остатка сахара другого. Поэтому углеводно-фосфатный остов молекулы имеет регулярную структуру. Каждая молекула ДНК характеризуется особой последовательностью пуриновых и пиримидиновых оснований.

Пуриновые и пиримидиновые  основания обращены внутрь двойной  спирали и расположены параллельно  друг другу и перпендикулярно  оси спирали. Две цепи удерживаются вместе при помощи водородных связей между парами оснований. Аденин всегда спаривается с тимином, а гуанин – с цитозином. Строгая специфичность спаривания обуславливает комплементарность, то есть взаимное соответствие последовательностей оснований в двух цепях. При этом полинуклеотидные цепи в двойной спирали ДНК отличаются одна от другой как последовательностью оснований, так и нуклеотидным составом. По своему химическому строению две цепи молекулы ДНК ориентированы противоположно (антипараллельные).

Важным свойством ДНК  является то, что 3,5-фосфодиэфирная связь  углеводно-фосфатного остова молекулы наиболее чувствительна как к химическому, так и к ферментативному расщеплению.

Для функционирования ДНК  в процессах репликации и транскрипции большое значение имеет возможность  лёгкого расхождения цепей при  определённом воздействии и их последующего воссоединения. Когда водородные связи между основаниями разрываются, цепи, образующие двухцепочную молекулу ДНК, расходятся. Денатурацию ДНК (плавление вторичной структуры) можно осуществить в растворе, увеличивая его температуру либо изменяя pH. Стабильность двухцепочного комплекса зависит от того, сколько он содержит GC-пар, связанных тремя водородными связями (АТ-пара соединена двумя водородными связями). Чем выше молярное содержание GC-пар, тем выше температура или pH, при которых происходит плавление.

Денатурация обратима даже после полного разделения двух цепей. Если инкубировать комплементарные цепи при температуре примерно 25^оС ниже температуры плавления исходного дуплекса, то они начинают реассоциировать и при отдельных условиях образуют исходную спираль. Этот процесс называется ренатурацией или отжигом.

Ренатурация ДНК осуществляется в два этапа. Сначала в результате случайных столкновений одноцепочных молекул происходит правильное соединение коротких комплементарных отрезков. После образования таких двухцепочечных структур идёт быстрое  «схлопывание» по всей длине и восстановление исходной двуспиральной молекулы ДНК.

Транскрипция, то есть считывание с молекулы ДНК матричной рибонуклеиновой  кислоты (мРНК), соответствующей определённому  гену, осуществляется ферментом РНК-полимеразой. При этом первоначально РНК-полимераза взаимодействует с определённым районом ДНК, предшествующим кодирующей последовательности гена, - промотором. Связавшись с промотором, РНК-полимераза начинает перемещаться вдоль гена, синтезируя мРНК, комплементарную одной из цепей ДНК. Синтез мРНК происходит в направлении 5-3. Начало гена поэтому называют 5-концом, а конец гена, где происходит окончание транскрипции, - 3-концом. РНК-полимераза движется по кодирующей цепи ДЕН в направлении от 3-конца к 5-концу. По последовательности мРНК соответствует цепи ДНК, комплементарной кодирующей цепи (отличие состоит лишь в том, что в молекуле РНК вместо тимина находится урацил). Поэтому на практике очень часто записывают последовательность только одной этой цепи ДНК, что значительно облегчает восприятие структуры генетических элементов, так как 5- и 3-концам мРНК, а последовательность нуклеотидов цепи ДНК соответствует последовательности мРНК.

По мере своего перемещения  РНК-полимераза расплетает и затем вновь заплетает последовательные короткие участки ДНК. Двухцепочечные гибриды РНК-ДНК, образующиеся в процессе транскрипции, существуют лишь очень непродолжительное время. Новосинтезированные цепи РНК быстро отделяются от транскрипционного комплекса, после чего транскрибированные участки ДНК возвращаются в нативное состояние.

Трансляция с мРНК белковой молекулы происходит последовательно, начиная с 5-конца матрицы. Первую аминокислоту белковой цепи называют Т-концом (или амино-концом), а последнюю  – С-концом (или корбокси-концом).

Методы генной инженерии.

С появлением методологии  генетической инженерии появилась  реальная возможность искусственного конструирования функционирующих  рекомбинантных («химерных») молекул  ДНК в соответствии с замыслом исследователя, и в настоящее время эта методология допускает конструирование in vitro любых желаемых  генов. Разработка методов выделения индивидуальных генов практически любых организмов посредством их клонирования в бактериальных клетках явилась одним из крупнейших достижений молекулярной биологии. Такие клонированные гены (индивидуальные гены в составе векторных молекул) можно переносить из клеток одних организмов в клетки других видов, как близко родственных, так и эволюционно отдалённых.

Объединение в начале 1970-х гг. до того независимо разрабатываемых методов позволило создать современную стратегию генетической инженерии, суть которой заключается в следующем:

1. в небольшую молекулу ДНК, способную реплицироваться в клетке автономно от хромосомы (плазмиду или вирусную ДНК), ферментативно встраивают фрагменты молекул ДНК любого изучаемого организма или искусственно синтезированные сегменты ДНК;
2. образующиеся при этом молекулы (гибридные ДНК), вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются, размножая в своём составе встроенные фрагменты ДНК;
3. определёнными методами отбирают клоны клеток или вирусов, содержащих индивидуальные типы молекул гибридных ДНК;
4. выявленные гибридные ДНК подвергают разностороннему структурно-функциональному изучению, особую роль при этом играют высокоэффективные методы расшифровки последовательности нуклеотидов (секвенирования) фрагментов ДНК.

Мощным инструментом генной инженерии  являются открытые в 1974 году ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или  рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для разрушения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определённые последовательности нуклеотидов (так называемые сайты – участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты», называемые липкими хвостами.

1. Методы конструирования гибридных молекул

1. Коннекторный метод

В 1972 г. П. Берг с сотрудниками впервые сообщили о получении in vitro гибридной молекулы, состоящей из ДНК вируса SV40 и ДНК фага λdvgal. При данном использовался метод, получивший название коннекторного. Принцип одного из вариантов этого метода заключается в следующем. К 3’-концам одного из рекомбинируемых  in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достраивают одноцепочечные олиго(dA)-сегменты определённой длины. При смещении полученных таким образом фрагментов формируются кольцевые структуры за счёт водородных связей между олиго(dA)- и олиго(dT)-последовательностями. Одноцепочечные бреши гибридных молекул ДНК застраивают с помощью ДНК-полимеразы I E.coli и цепи ковалентно сшивают в лигазной реакции.

Коннекторным методом  удаётся рекомбинировать  in vitro фрагменты ДНК, полученные любым из способов расщепления исходной ДНК (механическим, ферментативным). При данном используют синтетические комплементарные олиго(dA)∙олиго(dT) или олиго(dG)∙олиго(dC)-концы. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод.

Однако этот метод  имеет и недостатки. Часто выделение  встроенного фрагмента из гибридной  молекулы ДНК затруднено. В ряде

Достижения генной инженерии.

Улучшение эффективности методов  генной инженерии позволило учёным совершить множество открытий, которые  применяются теперь в различных  сферах деятельности человека.

Успехи  в области генной инженерии привели  к тому, что многие гормоны производят уже в больших количествах как исключительно важные лекарственные средства. Синтез участка ДНК – гена человека, который ответственен за синтез гормона роста, обеспечил его производство. С 1980 года гормон роста человека соматотропин получают из бактерии E.colli (кишечной палочки). Соматотропин представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 191 аминокислоты. Он вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела, а его недостаток приводит к карликовости. Применение этого гормона в лечении детей, у которых задержан рост из-за недостатка гормона роста, обеспечивает их нормальное развитие. Соматотропин – единственное средство лечения детей, страдающих карликовостью из-за недостатка этого гормона. До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.