Генетика микроорганизмов

Особой формой изменчивости, в основе которой лежат мутации, представляется диссоциация (расщепление признаков) бактерий. Примером диссоциации может служить образование двух типов колоний при рассеве чистой культуры бактерий на твердой питательной среде. Первый тип — R-колонии (от англ. rough — неровный), имеющие неровные края и шероховатую поверхность, и второй тип — S-колонии (от англ. smooth — гладкий) круглой формы с гладкой поверхностью. В процессе диссоциации изменяется не только морфология колоний, но и физиолого-биохимические и другие свойства бактерий.

Мутации, вызываемые искусственно при  помощи химических или физических агентов, которые поддаются контролю, называются индуцированными мутациями. Впервые  индуцированные мутации дрожжей были получены при помощи рентгеновских лучей в 1925 г.           Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым.

В тех  случаях, когда фактор, вызвавший  мутацию, неизвестен, ее считают спонтанной. Вызывать мутации могут различные  химические вещества: алкилирующие соединения (этил- и метилме-тансульфонат, диметил- и диэтилсульфат), этиленимин, азотные и серные аналоги иприта, аналоги оснований, соединения мышьяка и хрома, уретан, креозот, деготь, органические перекиси, минеральные масла, половые гормоны, растительные ауксины, ростовые вещества бактерий и растений и другие, а также физические факторы: рентгеновское и ультрафиолетовое излучение, ү-лучи и т. д. Механизм действия мутагенов различен.

До последнего времени геном  бактерий рассматривали в определенной степени как пассивную мишень, подвергаемую повреждающему действию мутагенных факторов. При исследованиях бактерий выявлено, что их клетки обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения ДНК. Восстановление, или репарацию, поврежденной ДНК осуществляют ферменты, которые находятся под контролем специальных генов. Клетки бактерий могут репарировать повреждения ДНК, вызванные как излучениями, так и химическими мутагенными веществами.

Единичный мутант у бактерий выявляют культивированием популяций в обстановке, благоприятной его росту. В практических условиях отбор форм измененного типа выполняют пересевом культуры на агаровую среду, где возможен рост только мутантов. Можно подобрать и жидкую избирательную среду, на которой мутант становится преобладающей частью популяции. В некоторых случаях мутации встречаются в достаточно большом количестве и их можно обнаружить без отбора.

Рекомбинации. У организмов развились и другие механизмы, способствующие возникновению в потомстве резко измененной наследственности. Эти механизмы заключаются в следующей за этим немедленной перетасовке - рекомбинации генов, принадлежащих близкородственным, но генотипически различным организмам. При генетической рекомбинации в хромосому одной микробной клетки, служащей реципиентом (от лат. recipientis - получающий), встраиваются фрагменты хромосомы микроорганизма, служащего донором (от лат. dono - дарю).

Генетические рекомбинации у эукариот - это образование индивидуумов с  новым сочетанием признаков в  результате полового процесса. Новая особь получает несколько генов от одного родителя и несколько — от другого, генетически отличающегося родителя. Благодаря процессу рекомбинации увеличивается число наследственных изменений, на которые может воздействовать отбор.

У прокариот генетическая рекомбинация относится к так называемым парасексуальным процессам. Способность к рекомбинации генов может быть представлена в виде следующей примерной схемы:

Донор           а  б в  г  д е  ж  з                                                                

 →  Рекомбинант   АБвгдЕЖЗ      

Реципиент    А Б В Г Д Е Ж З

У микроорганизмов известны три  процесса, посредством которых генетический материал от двух различных родителей может рекомбинировать. Это трансформация, конъюгация и трансдукция. Однако ни при одном из этих процессов не происходит истинного слияния клеток или полного слияния нуклеоидов. Лишь часть генетического материала клетки-донора передается клетке-реципиенту.

В такой неполной зиготе, называемой мерозиготой, сформированной в результате переноса генов, генетический материал реципиентной клетки называется эндогенным, а генетический фрагмент, переданный от донора, — экзогенным. Обычно экзогенная и эндогенная части соединяются и обмениваются сегментами немедленно после переноса.

Трансформация. Это процесс переноса генов, при котором часть ДНК клетки-донора, полученная либо экстрагированием, либо при естественном лизисе клеток, может проникать в родственную (одного и того же вида или близкородственных видов) бактериальную клетку-реципиент. В результате в ДНК реципиента включаются фрагменты хромосомы ДНК донора, что обусловливает изменение признаков бактерии-реципиента.

Процесс трансформации можно подразделить на несколько стадий:

•   первая — контакт ДНК с поверхностью клетки;

•   вторая — проникновение ДНК в клетку;

•   третья — соединение трансформирующей ДНК с соответствующим фрагментом хромосомы реципиента.

Дальнейший процесс связан с  рекомбинацией части экзогенной молекулы трансформирующей ДНК с реципиентной эндогенной хромосомной ДНК. Последняя стадия — репликация включенной в хромосому новой информации.

В лабораторных условиях искусственную  трансформацию выполняют следующим  образом. Извлекают ДНК определенного  штамма бактерий, очищают и смешивают с клетками бактерий другого штамма, отличающегося от первого одним или несколькими наследственными свойствами. Культуру подопытного микроорганизма оставляют расти. Среди потомства можно обнаружить небольшое количество клеток с некоторыми свойствами штамма, из которого была извлечена ДНК.

Очень редко встречаются случаи, когда единичная бактериальная клетка приобретает в результате трансформации более чем одно новое свойство. Передача через ДНК большего числа признаков наблюдается лишь в том случае, если культура микроба-донора генетически близка к клеткам микроба-реципиента. При помощи трансформирующейся ДНК могут передаваться такие признаки, как капсулообразование, синтез необходимых клетке веществ, ферментативная активность, устойчивость к ядам, антибиотикам и другим лекарственным веществам.

Трансформация отмечена у многих видов  бактерий, в частности у представителей родов Bacillus, Rhizobium, Streptococcus и др.                      С использованием трансформации получено много штаммов микроорганизмов, представляющих большое практическое значение.

Конъюгация - процесс, при котором сблизившиеся родительские клетки соединяются при помощи конъюгационных мостиков, через последние происходит обмен генетическим материалом. Конъюгацию исследовали у различных видов бактерий (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), она хорошо изучена у Escherichia coli.

Возможность клетки стать донором  определяется специфическим половым фактором F (от англ. fertility - плодовитость), который при конъюгации переносится из одной бактериальной клетки в другую. Клетки, связанные конъюгацией, называют F+-клеткам и. Клетки бактерий, не имеющие F-фактора, служат реципиентами генетического материала и обозначаются F^-. Половой фактор F относится к числу конъюгативных плазмид и представляет собой кольцевую молекулу ДНК молекулярной массой 64*106 а.е.м.

F-плазмида обусловливает образование на поверхности клетки одной или двух так называемых половых фимбрий, получивших название         F-пили, способствующих соединению клеток-доноров с клетками-реципиентами, а также обеспечивает независимую от хромосомы репликацию собственной ДНК и образование продуктов, которые управляют переносом генетического материала как самой F- плазмиды, так и хромосомы клетки. F-плазмида располагается в цитоплазме автономно, вне бактериальной хромосомы. Бактерию с F-плазмидой называют плазмидосодержащим трансконъюгантом. F-плазмида обладает способностью включаться (интегрировать) в определенные места бактериальной хромосомы и становиться ее частью. В таком случае бактерия получает название хромосомального трансконъюганта.               F-плазмида может быть утрачена вследствие ее распада под действием дезоксирибонуклеазы. В последнем случае бактерия обозначается как абортивный транс-конъюгант.

В результате интеграции F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы образуется так называемый Hƒr-штамм (от: High frequency of recombination — высокая частота рекомбинации). Когда происходит скрещивание Hƒr -штамма с F^--бактериями, то, как правило, F-фактор не передается, а гены хромосомы бактерии передаются с довольно высокой частотой. В начале процесса конъюгации клетки-доноры F+ или Hƒr соединяются с клетками-реципиентами (благодаря наличию у доноров    F-пилей). Впоследствии между клетками образуется конъюгационный мостик, и через него из клетки-донора в клетку-реципиент передается генетический материал — F-плазмиды или хромосомы. Обычно при конъюгации передается только одна цепь ДНК-донора, а вторая цепь (комплементарная) достраивается в клетке реципиента. Перенос, как правило, начинается с одного конца хромосомы и продолжается с последующим переносом других участков ее.

Переносу генетического материала  можно препятствовать в любое  время, разделяя конъюгирующие пары при помощи сильного встряхивания суспензии микроорганизмов, находящихся в жидкой среде. В этом случае только некоторые свойства мужских клеток переносятся в женскую клетку и проявляются в потомстве. Рано или поздно перенос прекращается в большинстве конъюгирующих пар и тогда, когда их искусственно не разделяют. Это происходит потому, что конъюгационный мостик непрочен и легко разрушается, не влияя на жизнеспособность клеток.

Таким образом, в результате конъюгации реципиентная F-клетка превращается в мерозиготу, содержащую вследствие самопроизвольного прерывания переноса генетического материала только часть хромосомы F^--донора в дополнение к собственной хромосоме. В результате кроссинговера (перекрест хромосом, при котором гены меняются местами) образуется новая комбинация генетическою материала. В зависимости от места расположения подвергающегося обмену генетического материала в потомстве могут возникнуть рекомбинанты неодинакового типа.

Трансдукция у бактерий. Это перенос генетического материала от одной бактериальной клетки к другой посредством бактериофага. Другими словами, фаг при этом играет как бы роль гаметы, перенося в клетку-реципиент фрагмент ДНК клетки-донора. Трансдукция происходит при участии умеренных фагов.

Известны три главных типа трансдукции: общая (неспецифическая), локализованная (специфическая) и абортивная. При неспецифической трансдукции различные фрагменты ДНК передаются от бактерий-доноров к бактериям-реципиентам с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. При этом принесенный фагом фрагмент ДНК донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента при рекомбинации.

Специфическая трансдукция характеризует способность фага переносить от бактерий-доноров к бактерии-реципиенту только определенные гены. Это обусловлено тем, что образование трансдукцирующего фага происходит в результате соединения его ДНК со строго определенными бактериальными генами, расположенными на хромосоме клетки-донора. Считают, что каждая частица фага переносит или только один бактериальный ген, или несколько близко расположенных генов.

При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент хромосомы клетки-донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а располагается в ее цитоплазме автономно и в таком виде функционирует. При делении клетки-реципиента трансдуцирован-ный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т. е. наследуется однолинейно, в связи с чем утрачивается в потомстве.

При трансдукции возможен перенос  генов, контролирующих питательные  особенности бактерий, их устойчивость к лекарственным веществам, ферментативную активность, наличие двигательного аппарата (жгутики) и другие свойства. Перенос признаков в процессе трансдукции обнаружен у представителей родов Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia и др.

Практическое использование достижений генетики микроорганизмов и генной инженерии в микробиологии

Получение наследственно измененных форм микроорганизмов расширило  возможности их использования в  сельскохозяйственном и промышленном производстве, а также в медицине. Основной метод получения новых форм микроорганизмов — индуцирование мутаций воздействием различными мутагенами на дикие, существующие в природе культуры. Таким методом удается создавать мутантов, которые выделяют в десятки и сотни раз большее количество ценных продуктов (антибиотиков, ферментов, витаминов, аминокислот и т. д.) по сравнению с дикими формами микроорганизмов.

Процесс получения высокопродуктивных штаммов микроорганизмов состоит из многих этапов. Сначала на культуру микроорганизма воздействуют различными мутагенными факторами с последующим отбором наиболее продуктивного штамма. Мутантный штамм могут подвергнуть дальнейшему воздействию мутагенов и последующему отбору еще более продуктивных форм. Часто из тысяч бесполезных мутантов отбирают только один высокопродуктивный штамм. В последние годы методом радиационного и химического мутагенеза микроорганизмов получено большое число промышленных штаммов микроорганизмов — продуцентов нужных человеку веществ.

Особенно широкие перспективы  переделки наследственной природы организмов сулит развитие генной, или генетической, инженерии — раздела молекулярной генетики, разрабатывающего методы создания новых генетических структур с заданной информацией и способы их переноса в клетки прокариот и эукариот.

Полученные методом генной инженерии  новые генетические молекулы представляют собой рекомбинантные ДНК, включающие два компонента — вектор (переносчик) и клонируемую «чужеродную» ДНК. Поскольку переносчик должен обладать свойствами репликона и обусловливать репликацию вновь созданной реком-бинантной ДНК, то вектором обычно служат такие репликоны, как плазмиды, умеренные фаги и вирусы животных. Все упомянутые переносчики имеют циркулярно замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК — это фрагмент ДНК, несущий необходимый ген (или гены), контролирующий образование нужного вещества.

Существуют различные приемы получения  рекомбинантных молекул ДНК. Наиболее простой из них начинается с обработки  изолированных молекул ДНК-вектора  и ДНК, несущей необходимый ген, ферментами-рестриктазами (эндонуклеазы рестрикции), расщепляющими  взятые  молекулы ДНК в строго определенном месте с образованием однонитчатых, комплементарных друг другу концов, так называемых «липких концов». Таков первый этап получения рекомбинантных ДНК, его иначе называют «разрезание» молекул ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции. Второй этап заключается в обработке полученных линейных молекул ДНК ферментом полинуклеотидлигазой, которая «сшивает» две разные молекулы в одну рекомбинантную ДНК. На третьем этапе рекомбинантные молекулы вводят в клетки тех или иных бактерий (методом трансформации. На завершающем, четверто, этапе выполняют клонирование трансформированных клеток.