Генетические основы онтогенеза

Для выявления потенции ядер в онтогенезе успешно применяется  метод трансплантации ядер. Первые опыты по пересадке ядер были проведены  на яйцеклетках амфибий. При этом в большинстве случаев после  пересадки ядер развитие шло только до стадии бластулы. Затем был проведен ряд интересных опытов по пересадке  ядер из клеток, находящихся на разных этапах дифференцировки, в денуклеированные яйцеклетки. В период второго деления мейоза или после него ядро яйцеклетки удалялось стеклянной иглой и на его место при помощи стеклянной пипетки переносилось диплоидное ядро, взятое из клеток более поздних стадий развития (бластулы, гаструлы и др.). Большинство таких опытов было проведено на лягушке.

При пересадке ядер из клеток поздней бластулы нормальное развитие наблюдалось менее чем у половины зародышей. В большинстве случаев  развитие проходило до стадии бластулы. При наиболее удачных пересадках лишь 35% оперированных яйцеклеток развивалось  до стадии свободно плавающих личинок (головастиков). Пересаженные в яйцеклетки «эктодермальные» и «хордо-мезодермальные» ядра из клеток гаструлы также в большинстве случаев обеспечивали развитие до бластулы, и только 8% таких яйцеклеток развивалось в личинки. При пересадке «эндодермальных» ядер значительно уменьшалось количество дробящихся яиц и количество случаев нормального развития, а личинок уже почти не было. Это позволило предположить, что в ходе гаструляции часть ядер уже претерпела необратимые изменения. Однако единичные случаи развития нормальных личинок указывают на то, что эти ядра содержат все факторы, необходимые для развития. Это окончательно подтвердилось результатами опытов по пересадке в денуклеированные яйцеклетки ядер из клеток кишечника головастиков и ядер из клеток глазного бокала [http://afonin-59-bio.narod.ru/2_heredity/2_heredity_self/hs_16_onto.htm].

Результаты опытов по пересадкам ядер позволили сделать следующее  заключение. Ядра соматических клеток генетически эквипотенциальны, т. е. они сохраняют всю генетическую информацию, свойственную данному организму. Дополнительно это подтверждается постоянством количества ДНК в ядре и числа хромосом. В различные  периоды функционирования ядер реализуется  только некоторая часть генетической информации, а оставшаяся оказывается  заблокированной. Деблокирование генетической информации ядер по мере развития становится все более и более затрудненным, но, по-видимому, оно возможно в любом  ядре, имеющем нормальный набор хромосом.

Таким образом, обычно дифференцировка  не связана с изменением числа  хромосом, обеспечивают же активацию  и инактивацию определенных генов в различные периоды онтогенеза какие-то специфические механизмы. Многоклеточные организмы должны иметь приспособления, контролирующие последовательность действия генов. Цитогенетические и биохимические исследования позволили вплотную подойти к решению этого чрезвычайно трудного и важного вопроса. Вполне определилось мнение о том, почему в ходе онтогенеза гены функционируют избирательно.

Клетки различных тканей растений и животных отличаются друг от друга главным образом тем, что в них происходит синтез различных  групп белков, что и определяет их структурную и функциональную специфику. Познать причины, которые  побуждают клетку синтезировать  только определенные белки, посредством  изучения синтеза и функциональных особенностей сотен различных белков задача непосильная. Такому изучению должно предшествовать познание закономерностей, определяющих избирательный синтез белков. Это и было сделано, когда  оправдалось предположение, что  дифференцировка происходит на хромосомном  уровне путем регуляции синтеза  специфической информационной РНК. При изучении гигантских (политенных) хромосом и хромосом типа «ламповых  щеток» было установлено, что в разных участках хромосом РНК синтезируется  с разной скоростью.

Установлено, что динамика образования пуфов на гигантских хромосомах в процессе развития двукрылых  является отражением смены активности генов. Пуфы представляют собой места  интенсивного синтеза информационной РНК. Интенсивное функционирование отдельных генов или их блоков соответствует определенным этапам развития и дифференцировки. Это  состояние непостоянно и обратимо, что очень хорошо видно в опытах по пересадке ядер из клеток слюнных  желез предкуколки дрозофилы в клетки зародыша, находящегося на более ранних этапах развития, причем на политенных хромосомах изменяются места появления пуфов. Все это иллюстрирует взаимодействие ядра и цитоплазмы в клетках с политенными хромосомами.

Много интересных работ проведено  по изучению механизмов, контролирующих образование пуфов. Есть основания считать, что одним из основных факторов в этом процессе у двукрылых является гормон экдизон, секретируемый проторакальной железой и вызывающий у насекомых линьку. Так, после введения этого гормона молодым личинкам довольно быстро возникают специфические пуфы, причем продолжительность их образования зависит от количества введенного гормона. Последовательность образования пуфов изменяется также при воздействиях различными химическими агентами или температурными условиями. Некоторые антибиотики, влияющие на обмен РНК (например, актиномицин), подавляют образование пуфов, а антибиотики, ингибирующие синтез белка (например, пуромицин), не влияют на этот процесс. Следовательно, активность пуфов находится под контролем гормональных факторов и факторов внешней среды. Формирование же комплексов пуфов, характерных для клеток отдельных тканей и органов дифференцированного организма, является показателем общего уровня наиболее интенсивно протекающих метаболических процессов в данных клетках. Правда, такие локальные изменения хромосом почти ничего не говорят о характере действия генов, но их изучение значительно расширило наши представления о роли хромосом и генов в функционировании клетки.

Связь синтетической активности с морфологическими преобразованиями хромосом была установлена при изучении оогенеза у амфибий, в ходе которого образуются хромосомы типа «ламповых щеток». При использовании метода авторадиографии была обнаружена строгая последовательность включения уридина в определенные участки петель хромосом этого типа и одновременное включение меченой аминокислоты в остальные участки петель, что позволило лучше представить механизм передачи информации от ядра к цитоплазме [http://afonin-59-bio.narod.ru/2_heredity/2_heredity_self/hs_16_onto.htm].

 Доказано, что ядрышковая РНК по нуклеотидному составу соответствует рибосомной РНК. Это совпадает с представлениями о том, что синтез рибосомальной РНК происходит на определенных участках хромосом. Синтезированная рРНК концентрируется в ядрышке, из которого формирующиеся рибосомы перемещаются в цитоплазму.

Таким образом, цитохимическое изучение хромосом типа «ламповых щеток» выявило их функциональное сходство с политенными хромосомами. Образование  пуфов и петель связано с повышением интенсивности синтеза информационном РНК. При снижении синтетической активности петли синтезированная РНК отделяется от хромосомы и петля спадает. Так же исчезают пуфы политенных хромосом.

3. Явление тотипотентности соматических клеток

Тотипотентность (totus – весь, целый и potenta – сила) свойство клеток реализовать генетическую информацию ядра до развития целого организма. Тотипотентность дифференцированных соматических клеток, т.е. их способность обеспечивать полное развитие организма свойственна и животным, и растениям. Одно из наиболее прямых доказательств этого факта — опыты английского генетика Дж. Гердона по трансплантации ядра из дифференцированной соматической клетки в безъядерную зиготу. Используя африканскую шпорцевую лягушку Xenopuslaevis, он получил взрослых особей на основе генетической информации ядра соматической клетки. Путем облучения большими дозами УФ из неоплодотворенных яиц функционально удалялось ядро; затем в каждое из энуклеированных яиц вводили дифференцированное ядро из клетки кишечного эпителия головастика, и таким способом инициировали развитие. В ряде случаев из подобных яиц развивались головастики, а затем и взрослые лягушки.

[http://dic.academic.ru/dic.nsf/es/90253].

Для доказательства того, что  в развитии участвовало именно трансплантированное, а не собственное ядро яйцеклетки (выжившее при УФ-облучении), применяли генетическое маркирование. Для выделения яйцеклеток использовали линию, характеризующуюся наличием в ядре двух ядрышек - по одному на каждый ядрышковый организатор двух гомологичных хромосом. Ядро соматической клетки было получено от особи, гетерозиготной по делеции ядрышкового организатора и потому имеющей в ядре только одно ядрышко. Все лягушки, развившиеся в результате пересадки ядер, имели по одному ядрышку. Несколько взрослых лягушек из их числа достигли половозрелости, и оказались вполне фертильными, как и нормальные Xenopus.

Эти эксперименты показали, что дифференцировка клеток в  онтогенезе не обязательно сопровождается необратимой инактивацией генетического материала ядра, ядро соматической клетки с репрессированной большей частью генома может претерпеть дерепрессию, если его трансплантировать в ооплазму оплодотворенной яйцеклетки, способной к реализации полного цикла развития.

В экспериментах нескольких типов было доказано, что вся информация, необходимая для нормального  развития, присутствует в ядре дифференцированной клетки и может быть вновь активирована и использована для повторения процесса развития. Таким образом, проблема генетического  контроля индивидуального развития перешла в рамки проблемы дифференциальной экспрессии генов, которая может  происходить на уровне любого известного матричного процесса. Концепция дифференциальной активности генов была выдвинута  в начале 30-х годов XX в. Т. Морганом. Согласно этой концепции во всех клетках  организма имеется одинаковый набор  генов, но функционируют они в  различно дифференцированных клетках  по-разному. В настоящее время  дифференциальная активность генов  в клетках и тканях разной специализации  и на разных этапах онтогенеза - это  экспериментально установленный факт универсального значения: в каждом данном типе клеток одновременно экспрессируется лишь небольшая доля генов, и спектры экспрессирующихся генов в клетках разных типов весьма специфичны.

4. Дифференциальная  активность генов в онтогенезе

Какие механизмы приводят к тому, что сестринские ядра, ведущие свое происхождение от одного и того же ядра зиготы, образуют при  дальнейших делениях дочерние ядра, вступающие на разные пути развития? Большая часть клеток животных – это соматические клетки, судьба которых - погибнуть, не внеся вклад в последующие поколения. Только зародышевые клетки, сегрегирующие в раннем эмбриогенезе, обладают тотипотентностъю (способностью пройти все этапы развития и дать начало любому типу клеток). Приводит ли дифференцировка клеток, происходящая после выбора какого-либо специфического пути развития, к селективной элиминации генов, которые не будут иметь экспрессии, или в этом случае происходит их постоянная инактивация?

В экспериментах нескольких типов получены данные, свидетельствующие  о том, что процессы развития не обязательно  приводят к необратимым изменениям клеточного ядра. Эти эксперименты показывают, что в соматических клетках  в процессе развития происходит дифференциальная экспрессия генов.

Одно из наиболее прямых доказательств этого факта демонстрация тотипотентности путем трансплантации ядра из дифференцированной соматической клетки в зиготу, лишенную ядра. Используя африканскую шпорцевую лягушку Xenopus laevis, Джон Гердон получил таким образом взрослых особей. Путем облучения большими дозами ультрафиолета из неоплодотворенных яиц функционально удаляется ядро; затем в каждое из яиц вводится дифференцированное ядро из клетки головастика; таким образом инициируется развитие. В ряде случаев яйца, в которые были введены ядра, развиваются во взрослых особей (рис. 17.1). Для доказательства того, что в развитии участвовало именно трансплантированное ядро, а не собственное ядро яйцеклетки, не погибшее при УФ-облучении, применяли генетическое маркирование. Для выделения яйцеклеток использовали линию, для которой было характерно наличие в ядре двух ядрышек по одному на каждый ядрышковый организатор двух гомологичных хромосом. Ядро соматической клетки было получено от особи, гетерозиготной по делеции ядрышкового организатора и имеющей поэтому в ядре только одно ядрышко. Все ядра в клетках особи, полученной в результате трансплантации ядра, имели только одно ядрышко. Таким образом, в этих случаях вся информация, необходимая для нормального развития, присутствует в ядре дифференцированной клетки и может быть вновь активирована и использована для повторения процесса развития.

Различными способами  было показано, что контроль первоначальных этапов дифференцировки делящихся  ядер определяется вне ядерными компонентами яйцеклетки, возникающими в процессе оогенеза. По крайней мере один из этих компонентов детерминанты будущих зародышевых клеток были идентифицированы и локализованы в яйцеклетке; показано, что они поступают только в клетки будущей зародышевой линии.

Детерминация клеток зародышевой  линии у дрозофилы контролируется факторами, присутствующими в ооплазме задней части яйца. Зародышевые клетки происходят от полярных клеток (рис. 17.2), которые образуются перед формированием клеточной бластодермы (что обсуждается ниже), когда некоторые из ранних ядер дробления мигрируют в заднюю часть яйцеклетки. Существование детерминантов полярных клеток было показано путем инъекции ооплазмы задней части яйцеклетки в передний конец других яйцеклеток, где в это время формировались полярные клетки. При этом возникал эмбрион, имеющий полярные клетки как в заднем, так и в переднем конце. Функциональность этих дополнительных полярных клеток демонстрируется путем их трансплантации в третий эмбрион, находящийся на стадии пребласт-дермы, где они объединяются с полярными клетками этого эмбриона (рис. 17.2). Во время гаструляции, когда начинается упорядоченное движение клеток, полярные клетки мигрируют внутрь эмбриона и объединяются с соматическими клетками гонады; их потомки участвуют в образовании гамет взрослого насекомого. Контрольные эксперименты показывают, что ооплазма, взятая не из задней, а из других частей яйцеклетки, при трансплантации не приводит к образованию полярных клеток. В сходных экспериментах по трансплантации показано, что детерминанты зародышевых клеток появляются в яйцеклетке во время поздних стадий оогенеза, перед окончательным формированием зрелой яйцеклетки.

Рис. 17.2. А. Полярные клетки в заднем конце эмбриона дрозофилы  образуются до формирования клеточной  бластодермы. По крайней мере некоторые полярные клетки затем мигрируют в соматические гонады, где образуются примордиальные зародышевые клетки. (По Gehring W., 1973. In: Genetic Mechanisms of Development, ed. by F.H. Ruddle, Academic Press, New York, p. 107.) Б. Присутствие детерминантов полярных клеток в задней части яиц Drosophila melanogaster можно доказать путем трансплантации этой ооплазмы в те части других яиц, где полярные клетки обычно не образуются. Показанный на рисунке донор цитоплазмы взят из линии, в которой как Х-, так и У-хромосомы маркированы доминантными мутациями Ваг (В и #*) для того, чтобы выявить возможный перенос донорского ядра вместе с полярной цитоплаз* мой донора. Яйца-реципиенты взяты из линии, гомозиготной по мутациям третьей хромосомы multiple wing hair (mwh) (множественные щетинки на крыльях) и ebony (черный цвет тела) (еу). Трансплантированная полярная плазма индуцирует образование полярных клеток в месте инъекции в яйцо- реципиент. Функциональная природа индуцированных полярных клеток выявляется путем их трансплантации в задний конец эмбриона, чья Х-хромосома маркирована рецессивными мутациями yellow (У) (желтый цвет тела), singed (sn3) (опаленные щетинки) и maroonlike (imat) (коричневый цвет глаз), где они участвуют в формировании зародышевых клеток. Часть (но не все) гамет, образуемых взрослыми мухами, развивающимися из таких эмбрионов^ несет маркеры mwhe4, а не маркеры ysn3 mal. Следовательно, индуцированные полярные клетки, генотип которых соответствует генотипу яйца-реципиента, являются инстинными полярными клетками. (По Illmensee К., 1976. In: Insect Development, ed. by P. Lawrence, Blackwell, London, p. 86.)